反硝化产碱菌Alcaligenes sp.TB氧化亚氮还原酶基因的克隆表达及酶学性质研究

氧化亚氮(N2O)是一种重要的温室气体,对全球温室效应的贡献非常显著,反硝化细菌中存在氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,Nos)能将其最终还原成氮气。将生物转鼓反应器中筛选得到的一株高效反硝化产碱菌Alcaligenes denitrificans TB作为供试菌株,构建含有nosZ基因序列的原核重组表达菌株,经IPTG诱导完成在大肠杆菌中的表达,其最佳诱导条件为:诱导剂IPTG终浓度为0. 5 mmol·L-1,诱导温度为28℃,诱导时间为6 h,菌体初始浓度(OD600)为0. 67。再利用亲和层析分离纯化得到重组蛋白,通过检测显示重组菌E. coli BL21(DE3)-pET28b-nosZ酶活力是出发菌株Alcaligenes sp. TB的2. 09倍,蛋白相对含量是其10. 58倍。进而考察了反应体系pH和反应温度对酶催化反应的影响,结果显示,当pH为7. 0,温度为40℃时得到最佳酶活。     

大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质

构建重组菌(JM109／pTre-99A-xylIV)作为极耐热木聚糖酶的生产菌株，研究了IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长的不同阶段加IPTG和温度对重组菌生产极耐热木聚糖酶的影响以及它的酶学性质．结果表明，IPTG诱导8h后极耐热木聚糖酶的表达量基本维持不变，0．5～5mmol／L浓度的IPTG诱导重组菌表达极耐热木聚糖酶的效果基本相同；当重组菌生长到OD600为1．2左右时加IPTG诱导最好，诱导温度对极耐热木聚糖酶表达水平的影响不大．重组耐热木聚糖酶的最适反应pH值为5．4～5．8，重组极耐热木聚糖酶的最适反应温度大于100℃，重组极耐热木聚糖酶在pH值4．2～7．5都比较稳定，重组极耐热木聚糖酶的温度稳定性好，在90℃下保温2h后残存酶活还有90％。     

小鼠肝脏羧酸酯酶的cDNA克隆、表达及应用

从小鼠肝脏中克隆羧酸酯酶（CES）基因家族成员Ces1f的cDNA,在大肠杆菌中表达,并验证重组酶对农药的作用。采用RT-PCR克隆Ces1f cDNA,与pUCm-T载体连接测序后,亚克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-Ces1f,转化到宿主菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,采用Ni柱对表达产物进行纯化并测重组CES的酶比活,利用HPLC验证重组酶对不同农药的作用。结果显示：成功获得纯化的77kDa的重组CES蛋白,其酶液的比活为55.37U/mg,HPLC检测发现重组CES对西维因、呋喃丹及甲基对硫磷等具有降解作用。成功表达重组CES,其对农药具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。     

阿魏酸酯酶基因工程菌发酵条件优化

以本实验室前期构建的重组大肠杆菌工程菌株为基础,为提高阿魏酸酯酶的表达量,通过试验设计,对工程菌株目的蛋白可溶表达条件进行优化。实验采用250 mL三角瓶中,内含50 mL(Amp 100 mg/L)的LB培养基,分别研究诱导温度、诱导物IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等对蛋白可溶表达量的影响。确定了阿魏酸酯酶工程菌可溶性表达最优条件为:过夜培养菌体以1∶100比例接种新鲜培养基,摇床转速200 rmp/min,在37℃下培养至OD600值为1.0时,添加终浓度为0.01 mM的IPTG进行诱导,诱导温度30℃,诱导时长为9 h,最终单位发酵液的酶活力为400 U/L。以上数据为阿魏酸酯酶重组工程菌的工业应用奠定了基础。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

耐热β—半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体pKK-223-3中，经IPTG诱导后，表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性，其相对分子质量与天然蛋白质相似，表达量为1．5U／mg，比出发菌株高10倍。     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

高表达PGA的枯草芽孢杆菌蛋白质组学研究

为了解外源蛋白高表达时枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统胞内蛋白质组的变化,实验建立了青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,PGA)高表达B.subtilis系统,可达到1.6 g/L的表达量以及10 U/mL的酶活;通过双向电泳技术(2-DE)分离PGA高表达以及低表达重组菌中胞内蛋白,软件分析结果显示,两者胞内蛋白表达差异极大;通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定出其中6个差异蛋白,其中4个与PGA高表达抑制菌体生长相关,而PhoR和YxiE则与PGA高表达分泌胁迫机制有关.     

黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化及热激对提高酶活的影响

对多种产柚苷酶菌株进行筛选,确定黑曲霉FFCC uv-11为发酵菌株,并进行发酵工艺优化,得到最佳条件为发酵时间120 h,接种量10%,培养基初始pH 6.0,碳源种类为柚皮苷,此条件下发酵酶活达到765.85 U/mL。研究热激对黑曲霉发酵产柚苷酶过程的影响,确定热激温度为35℃,热激时机为接种后30 h,热激时长为30 min,此条件下柚苷酶酶活可达970.90 U/mL,是未进行热激处理的1.27倍。     

醛糖还原酶cDNA的克隆和表达

醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系.用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR.经PCR、双酶切和序列测定鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定后,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得重组蛋白AR-(His)6.紫外分光光度法对AR-(His)6进行酶活检测,其比活力为0.45 U/mg,为下一步筛选具有抑制醛糖还原酶活性的化合物及开发有临床应用价值的醛糖还原酶抑制剂提供参考.     

重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化

利用基因工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)-SOD1,优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白(rAj-SOD1)。采用摇瓶发酵优化rAj-SOD1可溶性表达的条件,提高蛋白的表达产量。结果表明,在温度30℃、转速200 r/min、0.1 mmol/L IPTG诱导8 h条件下,菌体中rAj-SOD1蛋白表达量最大,达到315.59 mg/L。电泳检测结果表明,rAj-SOD1的纯度为96.7%,符合后续酶活要求。纯化后rAj-SOD1质量浓度为98.73 mg/L,收率为31.28%。邻苯三酚法对rAj-SOD1蛋白进行活性分析,结果表明,纯化的rAj-SOD1蛋白具有明显的抗氧化活性。     

念珠藻Fe-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据低等物种Fe-SOD核酸序列设计简并引物，以念珠藻基因组为模板，扩增获得了念珠藻Fe-SOD基因.将此基因重组至原核表达载体pET22b（＋），构建成工程菌pET-SOD，并转化至大肠杆菌宿主.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得Fe-SOD蛋白分子量约为28 kD，占全菌蛋白的78％，并以包涵体形式表达.经Ni2＋亲和层析柱纯化后，目的蛋白的SOD比活力达1 100 U/mg，在紫外可见光谱中表现出金属Fe的特征峰.肿瘤细胞共培养试验表明，此Fe-SOD具有一定的抗SPC-A-1肺腺癌细胞增殖的能力.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

克鲁维酵母菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达

从菊粉酶酶源菌株克鲁维酵母GKluyveromycesmarxianus)Y109中提取菊粉酶基因,PCR扩增Y109的菊粉酶基因inuB1,核苷酸序列测定分析表明inuB1的阅读框架全长1665bp,没有内含子,其中存在4个潜在的N 糖基化位点。以pPIC9K为表达载体,构建inuB1的酵母转化载体,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得菊粉酶基因工程菌GS115/inuB1。GS115/inuB1甲醇诱导发酵表达菊粉酶,inuB1基因重组胞外菊粉酶表观分子量为90kD(SDS PAGE),比酶活性是12.29U/mg。     

Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶（XDH）基因XYL2。将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶（TPI）启动子下，得到融合表达载体pYZ－XYL2。通过电转化方法将pYX－XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cereuisiaeW303-1A中，酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL12得到活性表达，酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0．6U左右，约为供体菌的2．4倍。与基因供体菌不同，木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导，为组成型表达。     

分解酒糟生物质的纤维素酶生产菌的筛选研究

从白酒糟采集的样品中分离到15株菌,经过刚果红染色,初筛得到产纤维素酶酶活较高的5株菌。纤维素酶和滤纸酶活研究结果表明,这5株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面均较强,其分解纤维素的酶活最高达到11.9 U/mL,而分解滤纸的酶活力则最高达到6.4 U/mL。最适产酶条件为:发酵时间72~96 h,发酵温度25~30℃。对酒糟发酵减重最高达18%。     

产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017的高密度培养条件优化

利用D-丝氨酸羟基转移酶可催化制备D-丝氨酸,对产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017的高密度培养条件进行了优化,确定最佳培养条件为:摇床转速230r/min,摇瓶种子培养时间6h,接种量12%,诱导时间在OD=14.0~16.0时,诱导温度28℃,诱导剂IPTG浓度为0.2mmol/L。在最佳的培养条件下培养,当OD达到50时,可得的酶活为259.6U/g(以湿菌体计)。     

克鲁维酵母菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达

从菊粉酶酶源菌株克鲁维酵母GKluyveromyces marxianus)Y109中提取菊粉酶基因，PCR扩增Y109的菊粉酶基因inuB1，核苷酸序列测定分析表明inuB1的阅读框架全长1665bp，没有内含子，其中存在4个潜在的N一糖基化位点。以pPIC9K为表达载体，构建inuB1的酵母转化载体，转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，获得菊粉酶基因工程菌GS115／inuB1。GS115／inuB1甲醇诱导发酵表达菊粉酶，inuB1基因重组胞外菊粉酶表观分子量为90kD(SDS-PAGE)，比酶活性是12．29U／mg。     

小麦麦谷蛋白高分子量亚基N端序列克隆及原核表达分析

为了探究麦谷蛋白高分子量亚基(HMW-GS)的N-末端结构域对面粉品质的影响,以HMW-GS的1Dx5的N-末端结构域(1Dx5-N)为目的基因进行序列克隆及原核表达,研究大肠杆菌BL21(DE₃)为载体菌进行转化,鉴定阳性克隆,以IPTG和乳糖作为诱导剂,并通过正交试验,筛选最佳的诱导条件。结果表明：1Dx5-N序列基因全长267 bp,共编码氨基酸89个,预测分子质量为16.211 kDa;经转化、阳性克隆鉴定后,证明了该表达载体能够在大肠杆菌中稳定遗传;IPTG和乳糖均可诱导1Dx5-N进行表达;SDS-PAGE表明1Dx5-N重组蛋白多为包涵体蛋白;IPTG诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃,浓度0.6 mmol/L,诱导时间16 h;乳糖诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃、质量浓度9 g/L、诱导时间16 h。通过对比发现,乳糖可代替IPTG诱导1Dx5-N蛋白表达。