康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达

将康氏木霉(Trichoderma koningii)总RNA反转录成cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR,合成约1.5kb的纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh I)基因.cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白.实验结果:cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达,重组蛋白pNPC酶活为15.6U/L,最适反应温度为45℃,最适pH值为5.0,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为70kDa.     

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值(C/P)达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。     

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值（C/P）达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。      

不同碳源诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

以不同碳源发酵培养康氏木霉,定时测定粗酶液的纤维素酶活:结合mRNA分析,提取诱导培养的菌体总RNA,进行RT-PCR扩增纤维素酶系的主要基因.结果显示,以微晶纤维素为碳源直接诱导培养康氏木霉3d,纤维素酶活力最高,CMC酶活达到17.58U/mL,P-NPC酶活达到11.39 U/mL,FPA酶活达到1.68U/mL;菌体的RNA进行RT-PCR能够较为稳定的扩增出纤维素酶系的主要基因CBH Ⅰ、CBH Ⅱ、EG Ⅰ、BG Ⅰ,推测结构相对完整的纤维类物质微晶纤维素对康氏木霉产纤维素酶诱导活性较高.表明纤维素酶合成的调节发生于预翻译水平,加入诱导物后引起纤维素酶基因转录表达,酶合成和表达调节是协同发生的.     

米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。     

康氏木霉ZJ4摇瓶发酵产纤维素酶的研究

本文以稻草为主要碳源，对几种真菌产纤维素酶的能力进行了比较研究，发现康氏木霉ZJ4产酶能力最强。研究了康氏木霉ZJ4发酵产纤维素酶的发酵条件，结果表明：康氏木霉ZJ4发酵产纤维素酶的培养基组成为（g／L）：稻草40，麦麸20，大麦粉16．5，（NH4）2SO410，装液量30mL，起始pH5．0。产酶条件为：培养温度28℃，转速200r／min，当培养时间为144h，纤维素酶活达到最高值。     

康氏木霉原生质体制备及再生条件研究

研究纤维素酶高产菌株康氏木霉原生质体制备及再生的适宜条件,为该菌细胞融合和诱变育种提供适宜的真菌状态。对影响原生质体形成和再生的各因素(菌龄、蜗牛酶浓度、酶解温度和时间、渗透压稳定剂的成分和浓度)进行试验比较。康氏木霉原生质体制备的最佳条件:菌龄22h,蜗牛酶浓度2.0%,酶解温度30℃,酶解时间2.5h,蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6mol/L NaCl,再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8 mol/L蔗糖。可以获得细胞融合和细胞突变诱导所需的原生质体数量。并观察到原生质体的释放方式主要有2种:顶端释放和段端位释放;以一种方式进行再生。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

牛肉风味强化肽表达条件的初步研究

牛肉风味强化肽(BeefyMeatyPeptide,BMP)最初是从牛肉的消化液中分离的八肽,能增强鲜味,可作为一种类似于谷氨酸钠的天然风味强化剂。文章介绍了利用基因工程技术在酵母菌中表达BMP的方法,对构建的Pichiapastoris酵母工程菌株X-33/pPICZαA-BMP进行了发酵表达,确定了菌株的表型、高密度生长及表达条件。试验结果显示:构建的工程菌株为甲醇利用慢表型Muts,优化后的种子培养基摇瓶条件下菌体密度OD600达到28。在pH3.0、诱导72h、甲醇添加量为0.5%的条件下BMP有最大表达,选用BSM有利于诱导表达BMP;建立了SephadexG-25分离纯化、RP-HPLC检测BMP的有效方法。     

甜味蛋白Brazzein在毕赤氏酵母中表达的初步研究

目的:采用pGAP ZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的甜味蛋白Brazzein毕赤酵母重组菌.方法:按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物.在上、下游引物分别引入Xba Ⅰ与Xho Ⅰ酶切识别位点,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra.将重组质粒线性化,电转导入毕赤酵母(Pichia. pastoris SMD1168)中,用高浓度的抗生素Zeocin筛选高拷贝转化子.将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析.结果:成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌.SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子质量与理论值一致,在诱导72h后目的蛋白表达量达0.12g/L.对纯化后的蛋白进行生物活性测定,经鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好.     

康氏木霉降解麸皮的研究

对实验室分离筛选的康氏木霉进行研究.研究和分析了滤纸酶活（FPA）测定法的最优酶解条件为：在60℃、pH4.5下酶解40min,酶与底物之比为1：2.康氏木霉的最优产酶条件为28℃下,培养4d,培养基pH为6.5,含水量为150%,接种量为5%.用同时去蛋白和淀粉的麸皮作为作用底物,麸皮的转化率可高达28.5%.     

康氏木霉诱变菌株纤维素酶系的分离纯化与酶学特性研究

探讨来源于康氏木霉诱变菌株SG0026 10L发酵罐发酵液中纤维素酶系的分离纯化过程及其酶学性质。采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析柱和CM-Sepharose FF阳离子交换层析等分离纯化技术,从康氏木霉诱变菌株发酵液中分离纯化得到3个电泳纯的纤维素酶系组分(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)。对纯化的电泳纯内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活进行测定,发现3种酶的比活力分别为4.67±0.06 IU/mg、5.16±0.08 IU/mg和12.52±0.12 IU/mg。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定其分子量,发现其分子量分别为78.1、91.2和83.1k Da。利用Linewaeaver-Burk法对3种酶的动力学参数进行测定,发现3种酶的Km值分别为3.84、6.62和6.21 mg/m L,Vmax值分别为2.29、1.74和2.19 mg/(min·m L)。在此基础上,对3种酶的反应温度和pH进行了研究,发现3种酶的最适反应温度分别为50、50和55℃,最适反应pH均为5.0。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒是\     

里氏木霉纤维素酶的纯化和性质

培养里氏木霉所得的纤维素酶粗酶液经硫酸铵盐析，透析脱盐和柱层析，紫外检测仪记录结果显示出四个蛋白质峰。经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳后有四条明显的蛋白质谱带。相对分子量分别为74，000、55，000、47，000、26，000左右。根据分子量大小和蛋白组份的含量分析，这四种组分可能是β—葡萄糖苷酶，CBHI，CBHII和EGI。本实验得到的纤维素酶最适作用pH值在5．0左右，最适作用温度50℃左右。酶在pH4．0—6．0以及温度低于50℃时较稳定。Hg^2 、Ag^2 、Al^3 、Pb^2 、Fe^3 对酶有强烈的抑制作用，而Mn^2 、Co^2 、Fe^2 、Zn^2 、Ca^2 对酶有一定的激活作用。     

蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

谷氨酰胺转氨酶(TGase或TG)是一种可催化蛋白质间形成异肽键,使蛋白质改性的天然酶制剂。本文以蛹虫草基因组为模板,通过PCR扩增得到TGase相似蛋白的基因片段tgM,将其与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-TG,在毕赤酵母中进行表达,实现目的蛋白的胞外分泌表达,结果发酵液中重组TGase的酶活力为100 U/L。本研究为TGase的异源表达及潜在的工业应用提供参考。     

重组毕赤酵母产a-葡聚糖酶甲醇流加控制的研究

本文在摇瓶发酵的基础上,利用5L发酵罐进行重组毕赤酵母甲醇诱导产Ⅸ．葡聚糖酶发酵条件的优化。结果表明,菌体湿重250g／L时开始诱导,诱导表达阶段溶氧控制在10％～20％,甲醇诱导90h时仪．葡聚糖酶酶活达330U／mL。