钴~(60)-γ射线辐照法对骨蜡中指示病毒灭活效果的验证

目的验证钴60-γ射线辐照对骨蜡中模拟污染指示病毒的灭活效果。方法将固体骨蜡制成腔壁0.7 cm厚的空心圆柱体的辐照用样品,空腔中分别加入6.61 Lg PFU/ml辛德毕(Sindbis)病毒、7.07 LgTCID50/0.1 ml脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和6.01 LgTCID50/0.1 ml猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),分别经5、10、15、20及25 kGy的钴60-γ射线进行辐照后,收集样品腔中的病毒液,采用噬斑形成法检测Sindbis病毒滴度,采用微量半数细胞病变法检测PPV和EMCV滴度。结果经不同剂量kGy钴60-γ射线辐照,Sindbis病毒、EMCV及PPV的病毒滴度随辐照剂量的增加而下降,辐照剂量增加至25 kGy时,可灭活3种病毒的量分别达6.03⁶.60 LgPFU/ml、6.256.60 LgPFU/ml、6.25⁶.32 Lg TCID50/0.1 ml和4.756.32 Lg TCID50/0.1 ml和4.75⁴.88 LgTCID50/0.1 ml以上。结论 25 kGy的钴60-γ射线对骨蜡中的包膜和无包膜病毒均有较好的灭活效果。     

pH值、辛酸钠浓度和灭活时间对病毒灭活效果的影响

目的探讨p H值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠用于人免疫球蛋白制品中加入的脂包膜指示病毒灭活效果的影响。方法向不同p H值和不同辛酸钠浓度的人免疫球蛋白制品中加入指示病毒伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),于30℃水浴条件下作用不同时间后,采用细胞病变法测定残余病毒滴度,对不出现病变的细胞盲传3代。探讨p H值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠灭活PRV效果的影响。结果在酸性p H值(4.6±0.2)条件下,当辛酸钠浓度在7~13 mmol/L时,均能在5 min以内灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml。在中性p H值(7.4±0.2)条件下,13 mmol/L辛酸钠能瞬时灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml,而7、9和11 mmol/L浓度的辛酸钠能灭活PRV 2.8、0.43和3.2 Lg TCID50/0.1 ml,均不能瞬时完全灭活病毒,但继续灭活至5 min,可灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml。灭活后不出现病变的细胞盲传3代未出现细胞病变。结论辛酸钠可有效灭活加入人免疫球蛋白制品中的脂包膜指示病毒PRV;且酸性p H值条件下,辛酸钠的灭活效果优于p H值中性条件;辛酸钠对指示病毒的作用是灭活而非抑制。     

验证低pH法灭活人白细胞干扰素α病毒的效果

目的 以HIV-1、VSV和Sindbis为模型病毒,验证低pH法(pH2.0)灭活人白细胞干扰素α病毒效果。方法 将模型病毒按1:9(V/V)加入干扰素中,混匀后调pH至2.0。4℃放7d后,测病毒滴度。未发现细胞病变(CPE)的样品须盲传3代并观察7d,若仍无CPE,则判定无病毒存在。结果 4 log的HIV-1、6.63 log的VSV和6.38 log的Sindbis病毒被灭活,干扰素活性未受影响。结论 低pH法(pH2.0)灭活病毒经济有效,可提高人白细胞干扰素的安全性。     

人纤维蛋白原干热病毒灭活效果及灭活前后的质量变化

目的 评价人纤维蛋白原干热病毒灭活效果及灭活前后的质量变化。方法 取3批人纤维蛋白原样品,按样品与病毒9∶1的体积比分别加入Sindbis病毒和脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）,冻干后,于（99.5±0.5）℃下干热灭活30 min。96孔微量细胞病变法测定病毒滴度降低量,考察人纤维蛋白原干热灭活效果;并对干热前/后样品进行可见异物、稳定性、纯度、凝固活力、SDS-PAGE、高效液相分子排阻色谱（high performance liquid chromatography-size exclusion chromatography,HPLC-SEC）、圆二色光谱、荧光光谱、差示扫描荧光（differential scanning fluorimetry,DSF）分析,以评价其质量变化。结果 3批人纤维蛋白原样品干热30 min,Sindbis病毒滴度降低量分别为6.13、5.88、6.00 LgTCID50/0.1 mL,EMCV滴度降低量分别为≥4.94、≥4.68、≥5.00 LgTCID50/0.1 mL。3批人纤维蛋白原样品干热前/...     

鼠神经生长因子病毒灭活效果的验证

目的对鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)病毒灭活工艺进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和Sindbis病毒为指示病毒,考察辛酸钠法对mNGF原液中病毒的灭活效果,并比较灭活后与未灭活原液的mNGF活性、纯度、等电点及其-20℃贮存0、3、6个月的稳定性。结果 mNGF原液经0.3%辛酸钠、pH(5.0±0.2)、(25±1)℃灭活90 min,PRV和Sindbis病毒滴度均下降6 lgCCID50/ml以上,灭活60、90 min样品盲传3代后,均未检测出病毒。灭活后与未灭活原液的mNGF活性无差异,比活性均在5.0×105 AU/mg以上,蛋白纯度均为100%,等电聚焦主区带均在8.65~9.30之间;-20℃贮存0、3、6个月,蛋白纯度均为100%,比活性均无明显差异,且6个月内比活性均未明显降低。结论辛酸钠法可安全、快速、高效地灭活mNGF原液中的指示病毒及其所代表的相关病毒,保证了产品的质量及其工艺的稳定性,保障了临床用药的安全性。     

终端干热法灭活凝血因子类制品中细小病毒的工艺验证

目的验证终端干热法灭活凝血因子类制品中细小病毒的灭活工艺,并对其灭活效果进行评价。方法以猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,模拟凝血因子类制品生产工艺中病毒灭活的工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测残余病毒滴度,验证终端干热法灭活病毒的效果。结果 3家企业生产的人凝血因子Ⅷ制品经100℃加热30min灭活,病毒滴度分别下降2.01～2.31、≥3.92和3.13～3.50LgTCID50/0.1ml;冻干与加热联合作用,病毒滴度分别下降2.82～3.00、≥4.24和4.00～4.12LgTCID50/0.1ml;5家企业生产的人纤维蛋白原经100℃加热30min灭活,病毒滴度分别下降3.50～3.63、2.56～2.70、3.06～3.57、3.00～3.25和≥3.75LgTCID50/0.1ml;冻干与加热联合作用,病毒滴度分别下降4.00～4.12、3.12～3.46、4.04～4.56、3.50～3.75和≥4.63LgTCID50/0.1ml。结论终端干热法对凝血因子类制品中的细小病毒具有一定的灭活作用,但由于工艺复杂、影响因素较多,不同企业生产的同类制品的病毒灭活效果不尽相同。     

采用低pH法灭活人乙型肝炎免疫球蛋白中的病毒

目的　考察人乙型肝炎免疫球蛋白 (HBIG)于低pH孵放下 ,其病毒灭活情况 ,及对抗—HBs效价、IgG组份的影响。方法　将HBIG原液调pH至 4 0于 2 4℃± 1℃孵放 2 1d ,以及将成品于 2～ 8℃放置 3年比较抗—HBs、IgG各组份指标的变化。结果　HBIG原液按上述条件病毒灭活效果可达到 7 0 0logTCID50 0 1mL以上 ,抗—HBs效价、IgG单体与二聚体 (D +M)的含量均有所下降。成品 2～ 8℃放置 3年 ,抗—HBs效价、IgG单体与二聚体的含量较稳定。结论　人乙型肝炎免疫球蛋白经低PH灭活病毒法灭活病毒有效 ,灭活后 ,抗—HBs效价、IgG单体与二聚体之和均有所下降 ,但其成品放于 2～ 8℃ ,抗—HBs效价、IgG单体与二聚体含量较稳定     

S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ制品中猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒灭活效果的验证

目的验证S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品中猪伪狂犬病病毒(pesdorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活效果。方法以PRV和PPV为指示病毒,模拟FⅧ生产工艺中的S/D及干热病毒灭活工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测3批FⅧ半成品的残留病毒滴度。结果批号为201203002、2012-04003、201204004 3批FⅧ半成品经(25±1)℃S/D灭活处理15 min后,PRV滴度分别下降≥6.5、≥6.8、≥6.8 lg TCID50/0.1 ml;经(100±2)℃干热灭活30 min后,PPV滴度分别下降4.00、3.92、3.94 lg TCID50/0.1 ml。结论 S/D法及干热法分别对FⅧ制品中PRV和PPV具有良好的灭活效果,本实验为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺的研究奠定了基础。     

两种低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果比较

目的比较两种低pH孵放法对静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)中脂包膜病毒的灭活效果。方法 IVIG中分别加入两种核酸类型的脂包膜病毒水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)及伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,以经典工艺(23～25℃灭活21 d)及新工艺[(37±0. 5)℃灭活9 h]低pH(pH为3. 8～4. 4)孵放法进行病毒灭活,分别检测不同灭活时间的病毒滴度,比较灭活效果。结果经典工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥5. 88 logTCID_(50)/0. 1 mL,对PRV的灭活效果≥6. 00 logTCID_(50)/0. 1 mL,且灭活的样品在敏感细胞盲传3代无细胞病变。新工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥4. 62 logTCID_(50)/0. 1 mL,对PRV的灭活效果≥6. 12 logTCID_(50)/0. 1 mL。结论两种低p H孵放法对指示病毒的灭活能力均符合国家标准,但经典工艺对两种指示病毒的灭活效果好且灭活彻底。     

低pH胃蛋白酶-甲苯消化法灭活破伤风免疫血浆中脂包膜病毒效果验证

目的验证低pH条件下胃蛋白酶-甲苯消化法对不同核酸类型的脂包膜病毒的灭活效果。方法以水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)作为RNA指示病毒,以伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作为DNA指示病毒,将破伤风免疫血浆样品经低pH(3.2±0.2)、0.2%甲苯、6～12活力单位胃蛋白酶处理后各取27 ml,分别加入3 ml指示病毒(9∶1),在(30.0±1)℃水浴中分别振摇10、30、60、90 min灭活病毒。以Vero细胞、PK-15细胞为基质,采用96孔细胞病变法检测残余病毒滴度,验证病毒灭活效果。结果破伤风免疫血浆样品经低pH胃蛋白酶及甲苯消化处理90 min后,VSV和PRV两种指示病毒的灭活效果分别为3.12～3.88和5.25～5.38 logTCID50/0.1 ml。结论采用低pH胃蛋白酶-甲苯消化法对破伤风免疫血浆中PRV灭活效果较好,而对VSV灭活效果有待提高。     

动物源性生物制品病毒灭活/去除工艺的验证

目的对动物源性生物制品病毒灭活/去除工艺进行验证。方法针对不同动物源性制品,选择相关的指示病毒,对4个厂家不同的病毒灭活/去除工艺进行效果验证。结果各工艺均可灭活/去除指示病毒4Logs以上,均为有效的灭活/去除病毒工艺。结论4个厂家的灭活/去除病毒工艺均可保证制品的安全性。     

凝血酶原复合物病毒灭活的研究

从Cohn’s组分Ⅲ制备凝血酶原复合物（简称PCC），并经S／D处理灭活病毒。通过加入标志病毒（VSV、Sindbis、仙台及EMC）考察病毒灭活效果。结果显示，因子Ⅱ、Ⅸ活性总回收率分别为52．2％和22．3％，纯化倍数分别为3．5和1．5，均比原制备工艺提高约2倍。对标志病毒的灭活效果分别达107．55TCID50／ml（VSV）、107．27TCID50／ml（Sindbis）、108．25TCID50／ml（仙台），而对非脂膜病毒EMC的灭活小于100．2TCID50／ml，表明S／D对灭活脂膜病毒有效，而对非脂膜病毒无效。TNBP残留量小于10ppm，Tween80残留量小于100ppm。所得制剂的溶解性及外观均比原制备工艺所得制剂有明显改善。     

肝水解肽的制备及其病毒灭活/去除工艺的验证

目的制备肝水解肽,并对其病毒灭活/去除工艺进行验证。方法以鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)为指示病毒,在100℃,pH6.0～7.0煮沸20min灭活病毒,用截留相对分子质量为10000的中空纤维柱,在进压0.15Mpa、回流压0.05Mpa和进压0.20Mpa、回流压0.10Mpa各循环超滤3次去除病毒,用无特定病原(SPF)的鸡胚和鸡成纤维细胞进行病毒灭活/去除的效果验证。结果加热煮沸后,指示病毒未检出,滴度降低NDV≥7.4logEID50/0.2ml、IBDV≥5.45logCCID50/0.1ml;超滤后IBDV未检出,滴度降低≥5.43logCCID50/0.1ml。盲传复壮均未检出病毒。制备的肝水解肽多肽含量均在20mg/ml以上。结论制备的肝水解肽工艺中两种灭活/去除病毒方法均有效,经灭活/去除病毒后的产品质量稳定。     

纤维蛋白原制剂灭活病毒工艺的初步研究

在纤维蛋白原(简称纤原)常规生产工艺中增加“有机溶剂/表面活性剂(S/D)”灭活病毒步骤·TNBP及Tween-80浓度分别为0.3％及1％,在24℃处理6小时,能有效灭活标志病毒VSV(7.31g_(10))及Sindbis V(6.831g_(10))。残余的TNBP及Tween-80可通过两次8％乙醇沉淀去除。病毒灭活后纤原的可凝固蛋白纯度由原来的70.9±8.5％提高至85.5±6.0％,回收率可保持在64.7±3.8％。PAGE电泳显示来出现新的蛋白区带。     

α_1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活

目的 从Ｃｏｈｎ　ＦⅣ中提纯α１－抗胰蛋白酶（α１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ　α１－ＡＴ，制备较高纯度α１－ＡＴ制剂。方法 对Ｃｏｈｎ ＦⅣ抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤，提纯 α１－ＡＴ用巴氏法（液态，６０℃，１０ｈ加热）作病毒灭活， 并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及合成基质法检测α１－ＡＴ蛋白及生物活性。用区带 扫描法测定α１－ＡＴ制剂的纯度。结果３批试制的α１－ＡＴ制剂的纯度为９１．３±１．５２％，比活０．４９±０．０８μ／ｍｇ，比活性 比抽提液提高了２７．４倍。巴氏法处理可使ＶＳＶ、Ｓｉｎｄｂｉｓ、Ｐｏｌｉｏ　Ｉ型疫苗病毒分别降低１０．０±０．３，１０．０±０．３１及７．１１ ±０．３ｌｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ，但仍能检出Ｐｏｌｉｏ型疫苗病毒。结论 可从 Ｃｏｈｎ ＦⅣ中制得较高纯度的 α１－ＡＴ制剂，巴氏法能对 α１－ＡＴ制剂作有效的病毒灭活处理。     

静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白的研制

目的研制高效价静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白。方法用甲型H1N1流感疫苗(简称甲流)对固定供血浆者按疫苗说明书免疫后2周开始采集原料血浆,采用血凝抑制法检测原料血浆和制品的甲流抗体效价;采用柱层析法从高效价甲流免疫血浆中提取富含IgM免疫球蛋白的样品,模拟低温乙醇蛋白分离法工艺从小量混合血浆分离IgG样品,测定血浆和提取样品的甲流抗体效价,分析甲流中和抗体效价与IgG、IgM含量的对应关系,判断甲流中和抗体的免疫球蛋白类型;按本公司静脉注射人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)生产工艺制备静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白,并与普通IVIG及相应合并血浆的甲流抗体效价进行比较。结果筛选到甲流抗体效价≥320 HU/ml的合格血浆9 866袋,合格率达33.5%,其中抗体效价≥640 HU/ml的血浆占合格血浆的49%,血浆质量符合《中国药典》三部(2010版)"血液制品生产用人血浆规程"要求;甲流抗体效价与IgG含量呈相应比例关系,而与IgM含量无关,甲流中和抗体的免疫球蛋白类型以IgG为主;制备的甲流人免疫球蛋白制品的甲流中和抗体效价达2 560 HU/ml,为普通IVIG的197倍,其他质量指标符合《中国药典》三部(2010版)"静注人免疫球蛋白制检规程"要求。结论成功研制了静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白,在甲流疫情得到有效控制的情况下,仍具有战略储备意义。     

H5N1人用禽流感疫苗免疫原性检测方法的建立

目的确定人用禽流感疫苗免疫原性检测方法。方法用禽流感病毒R1203株制备疫苗,以不同剂量免疫家兔,检测血清中的血凝抑制抗体和中和抗体,并进行交叉血凝抑制试验、交叉单向免疫扩散试验和交叉中和试验。结果R1203株疫苗接种家兔1针后14 d,中和抗体和血抑抗体滴度均较低;第2针后14 d均明显升高。血抑抗体量-效反应不明显,而中和抗体量-效反应明显。交叉血凝抑制试验显示,异型之间普遍有交叉反应,滴度大部分不低于1∶40。单向免疫扩散试验显示异型之间无交叉反应。禽流感疫苗抗血清不能中和人流感病毒,但能中和同型病毒(R1194),滴度可达1∶240。结论中和抗体能正确反映疫苗的免疫原性;检测中和抗体的方法可用于禽流感疫苗的效力试验。     

HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的研制

目的研制HIV-1RNA血筛试剂国家参考品。方法收集HIV-1病毒培养物、我国不同地区的HIV-1感染者血浆以及正常人样品,经HIV-1病毒载量试剂检测,对HIV-1RNA阳性的样品进行env基因型分析,从中筛选参考品的候选样品。结果共筛选8份HIV-1RNA阳性的样品作为阳性参考品,病毒载量均高于5000IU/ml;8份HIV、HBV、HCV均为阴性的血浆样品作为阴性参考品;以1份病毒培养样品作为灵敏度参考品的原始样品,经WHOHIV-1RNA标准品标定,其HIV-1病毒载量为3.79×104IU/ml;反复3次冻融对参考品的病毒载量无明显影响。结论已制备HIV-1RNA血筛试剂国家参考品,为我国HIV-1核酸血筛试剂的质量控制和标准化提供了依据。