海参肠中溶菌酶的分离纯化及其酶学性质

从海参肠中分离纯化溶菌酶,并测定其酶学性质及抑菌作用。在4℃下将海参肠打浆,用Tris-HCl缓冲液抽提。上清液经浊点萃取法(CPE)浓缩、阳离子交换柱(CM52纤维素)层析和SephadexG-75凝胶过滤层析分步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。该酶的比活力达到3 026.1 U/mg,纯化倍数为18.7,活力回收为46.0%。对纯化的溶菌酶性质研究表明,该酶相对分子质量约为16 000,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH 6.5,在45℃以下和pH 4.0~8.0都有较好的稳定性,并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较,从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能,即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用。     

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法,以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究,构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现,30℃、140r/min、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导后继续培养14h,目的蛋白分泌表达量可达到30~40mg/L,且产物以大量可溶性蛋白存在。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

非融合海参溶菌酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶活鉴定

利用实验室已构建好的表达载体pET32a(+)-SjLys,在基因工程菌RoSetta(DE3)plysS中表达重组融合海参溶菌酶rSjLys。利用融合的组氨酸标签,通过Ni 2+-NTA层析柱分离、纯化,获得高纯度的重组海参溶菌酶。利用重组牛肠激酶在22℃、pH 7.4、16h条件下对目的蛋白rSjLys的融合标签Trx-His-S tag进行完全酶切,通过Ni 2+-NTA层析柱纯化得到纯度大于99%的非融合的海参溶菌酶SjLys。实验结果表明,作为i型溶菌酶,与rSjLys比较,非融合海参溶菌酶对指示菌溶壁微球菌具有明显的抑菌作用。     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticillium mobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥，制得粗酶粉的酶活约为1033U／g。对粗酶研究发现，该酶的最适反应温度为52℃，最适pH为6.0；粗酶的pH稳定范围在4－8，温度稳定范围在20－40℃，离子强度对该酶的活性稍有影响，粗酶经CM－纤维素层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后得到较纯的酶，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度，得到较弱的单一区带，其中，CM－纤维素层析的纯化倍数为4.5，收率质量分数约为78.8%；凝胶过滤层析纯化倍数为1.11，收率质量分数为50％；用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092。     

溶菌酶及其应用研究进展

溶菌酶具有抗菌消炎,提高免疫力,抑制外源微生物生长等独特功效,且无毒无害.因此,越来越多的研究人员开始关注溶菌酶.本文综述了关于溶菌酶的分离纯化方法,包括超滤法,亲和萃取法,离子交换法和吸附法.以及对溶菌酶的应用研究进展进行总结.最后,对溶菌酶的制备和应用进行了展望.     

海参溶菌酶C端多肽的异构肽酶活性

海参溶菌酶C端多肽与5种异构肽酶的氨基酸残基序列比对发现,其具有较高同源性,维持异构肽酶活性的两个关键位点组氨酸(His)和丝氨酸(Ser)也高度保守。水解底物L-γ-Glu-pNA生成4-硝基苯胺的实验结果表明,C端多肽具有异构肽酶活性。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能有效破坏蛋白酶活性,表明Ser是异构肽酶rSjLys-C的关键活性位点,即rSjLys-C属于丝氨酸蛋白酶。确定最适催化条件为37℃、pH 7.4、NaCl 50 mmol/L。rSjLys-C的酶促反应动力学参数Vmax为1.446×10~(-5) mmol/(L·s),K_m为0.395 7mmol/L,k_(cat)为1.509×10-3 s~(-1),k_(cat)/K_m为23.813L/(mol·s)。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

海参水煮液中ACE抑制肽的分离纯化

采用大孔树脂吸附的方法对海参水煮液酶解物多肽进行分离。用30%、60%和90%乙醇水溶液依次洗脱,得到3种多肽。对所得多肽进行ACE抑制活性测定,发现其IC50分别为3.01、0.98和2.88mg/mL。应用Rp18反相硅胶柱和LH-20葡聚糖凝胶柱对活性最高的组分进行ACE抑制肽分离纯化,得到2种多肽单体,ACE抑制活性的IC50分别为0.74和1.77mg/mL。     

海参肠碱性磷酸酶的提取及粗酶的特性研究

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是最重要的磷酸酶之一,在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢过程。本文研究了海参肠碱性磷酸酶粗酶的提取,并分析了其酶学特性。经含有0.2%Triton X-100的Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)浸提、正丁醇处理、70%硫酸铵沉淀和超滤等步骤获得海参肠ALP粗酶,纯化倍数达到2.74倍,得率为63.32%。ALP粗酶的最适反应pH为11.0,在pH 10.0～12.0稳定性较好;最适反应温度为45℃,在20～45℃具有很高的稳定性。金属离子Mg2+(1～30mmol/L)、Zn2+(<10mmol/L)对海参肠ALP粗酶具有显著的激活作用;Fe3+、Fe2+、Cu2+和Mn2+(10mmol/L)可明显抑制该酶活力。EDTA-Na2、DTT、Na2WO4及Na2HPO4对海参肠ALP粗酶有明显的抑制作用,抑制程度依次为:EDTA-Na2>DTT>Na2WO4>Na2HPO4。     

海参卵中类胡萝卜素提取条件的优化

采用有机溶剂浸提法,通过单因素试验结合正交试验,对海参卵中类胡萝卜素的提取条件进行了优化。结果表明,在以乙酸乙酯为提取溶剂、二次提取,提取温度40℃,提取时间3h,料液比1∶12的提取条件下,可以达到最优提取,类胡萝卜素质量分数可达63.20μg/g。     

盐藻水溶性多糖的提取和纯化

采用热水浸提法提取盐藻中的水溶性多糖,通过正交试验,对影响多糖得率的参数如温度、时间和水料比进行优化,确定了盐藻多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度85℃,时间300min,水料比20∶1,在此条件下多糖得率为13.09%。利用DEAE-52纤维素柱层析纯化经脱蛋白和透析处理的多糖,得到1种中性多糖和2种酸性多糖,经Sephadex G-100柱洗脱后仍显示为单一峰。 更多还原     

海参肠道酵母菌产胞外多糖的抗氧化性

研究了3株源于海参肠道的酵母菌HS-J6,HS-J8和HS-J9中胞外多糖的提取及其抗氧化活性。采用95%乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、透析、冷冻干燥获得其胞外粗多糖,分别命名为EPS6、EPS8和EPS9,采用3种方法测定它们产胞外多糖的抗氧化能力。结果表明,3种胞外多糖都具有一定的抗氧化能力,EPS6和EPS8的还原力相近,明显高于EPS9。EPS9对O-2·的清除能力最强,清除率最大为35.3%;EPS6对·OH的清除能力最强,最高可达91.5%。