生物反应器微载体规模化培养轮状病毒重配株LH9

目的利用Vero细胞生物反应器微载体培养技术规模化培养轮状病毒重配株LH9(G4型)。方法用3 L生物反应器,以4 g/L载体浓度培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,分别用含2、1、0.75、0μg/ml胰酶的DMEM培养液,35℃连续培养21 d,观察细胞生长状态。分别按0.5、0.1、0.05、0.01 MOI接种轮状病毒重配株LH9(G4),培养过程中每日取样,检测病毒滴度以及葡萄糖、乳酸含量。根据培养过程中葡萄糖、乳酸含量的变化,确定病毒培养过程中的收获时间,优化培养工艺。结果在反应器中用含不同浓度胰酶的DMEM培养Vero细胞,细胞形态良好,与不含胰酶的DMEM培养液培养的细胞无明显差异;按0.05 MOI接种后的病毒收获液滴度较高,可达7.0 lg CCID50/ml,且持续时间较长;通过对病毒培养液中葡萄糖、乳酸含量的监测,调整了培养过程中的收获时间,收获次数增加至4次,可收获病毒液4个工作体积,病毒高峰滴度可达8.5 lg CCID50/ml。结论采用生物反应器微载体系统培养轮状病毒重配株LH9(G4),可显著提高病毒滴度,通过对培养过程的优化,增加了病毒收获量,为进一步规模化生产轮状病毒疫苗奠定了基础。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。     

Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化

目的优化轮状病毒基因重配株(UD株)在Vero细胞上培养的关键条件。方法将轮状病毒基因重配株(UD株)分别以0.01、0.03、0.05和0.10 MOI接种Vero细胞,分别于接种病毒后6、12、24、36、48、72、84、96、108、120 h取样,观察细胞病变(CPE)情况,计算半数感染剂量(CCID50/ml)。以0.05 MOI接种Vero细胞,分别加入含1、2、3、5、8和10μg/ml胰蛋白酶的M199培养液,于接种病毒后12~48 h,观察CPE情况,检测病毒滴度。结果以0.05 MOI接种Vero细胞后,维持液中胰蛋白酶浓度为5μg/ml,培养时间为48 h时,滴度达到最高,为6.5 lgCCID50/ml,且对Vero细胞的分裂增殖无不良影响。结论通过对Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化,获得了提高病毒滴度的有效方法,为使用Vero细胞培养轮状病毒制备轮状病毒减毒活疫苗奠定了基础。     

生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型

目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×10~5个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达最高,约7.75 TCID_(50)/ml。结论成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。     

悬浮Vero细胞快速扩增轮状病毒

目的探讨在悬浮Vero细胞中快速扩增轮状病毒(RV)的方法。方法 Vero细胞经消化后,直接接种KMG1b7株RV。采用微量滴定法、PAGE和RT-PCR等方法比较悬浮扩增、静置培养及微载体发酵培养RV的感染性滴度、基因组核酸带型和型特异VP7基因序列;采用电镜观察和Westernblot鉴定悬浮扩增RV的形态及结构蛋白的抗原性。结果悬浮细胞扩增的RV接种24h后病毒感染性滴度达峰值,为6.00lgCCID50/ml;而静置培养和微载体发酵培养分别在接种后(96±24)h和(48±6)h达峰值,分别为(6.00±0.25)lgCCID50/ml和(6.50±0.25)lgCCID50/ml。悬浮扩增的RV基因组呈典型的4-2-3-2G1血清型带型,G1型特异基因VP7序列未发生突变。悬浮扩增的RV形态和结构蛋白的抗原性未发生改变。结论在悬浮Vero细胞中扩增RV可以缩短病毒制备周期,提高病毒收获量,有利于RV疫苗的研制或生产。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的　采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法　用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果　培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论　用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒A_2株在不同细胞中的培养及其影响因素

目的在不同细胞中培养人呼吸道合胞病毒(HRSV),并分析其影响因素,为病毒的大量增殖创造条件。方法将HRSVA2株分别接种至人二倍体KMB17细胞、Vero细胞、人喉癌Hep-2细胞及HeLa细胞进行培养,采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度,并进行间接免疫荧光试验及合胞体观察。检测吸附时间、维持液pH值和培养温度对病毒增殖的影响。结果4种细胞中,Vero细胞对HRSV最敏感,病变早、病毒感染性滴度可达6.83lgCCID50/ml;KMB17细胞相对敏感性不高,但仍能良好增殖,病毒感染性滴度达6.13lgCCID50/ml;Hep-2细胞及HeLa细胞介于Vero细胞和KMB17细胞之间,病毒感染性滴度也达到6.83lgCCID50/ml。间接免疫荧光试验显示病毒在细胞浆内增殖。吸附时间对HRSV的增殖无明显影响;维持液的pH值对HRSV的增殖及病变特点均有一定的影响,在pH7.0～7.2时可快速引起细胞产生病变,并能达到最高感染性滴度;HRSV在37℃及32℃下培养均能良好地增殖。结论HRSVA2株在KMB17、Vero、Hep-2及HeLa细胞内均可增殖,但敏感性有一定差异,且对培养条件有一定的要求。     

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。     

应用微载体Vero细胞制备流行性乙型脑炎灭活疫苗最适条件的研究

应用微载体培养Vero细胞研究制备流行性乙型脑炎(简称乙脑)灭活疫苗的最适条件,包括微载体的选择和细胞培养以及细胞日龄、细胞密度、毒种浓度、病毒维持液pH、种毒方式等。并按初步选择的最适条件试生产疫苗,其病毒滴度达log7.33～8.09pfu/ml,其效力(ID_(50))为0.000017～0.000063毫升,均高于现行地鼠肾细胞培养疫苗的水平。     

狂犬病毒在Vero细胞上的传代适应

本文研究了3株狂犬病毒(C_(42)、C_(103)及4aG株)在Vero细胞上的培养条件和方法,并通过连续传代培养,选出1株滴度平均达到7.13LogLD_(50)/ml以上,达到WHO规定的不需浓缩的标准(≥10~(7.0)ICLD_(50)/ml)毒株—C_(42)—V_(170)病毒的增殖高峰由原来的10天左右提前到3～5天。另外2株的病毒滴度也达到了WHO规定的制备人用Vero细胞狂犬疫苗(PVRV)的标准(≥10~(6.0)ICLD_(50)/ml)。3株病毒都能在Vero细胞上产生蚀斑,符合WHO提出的疫苗生产毒种的要求。