百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

集成干扰素突变体的构建、表达及纯化

目的构建高效且可供单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)定点修饰的集成干扰素突变体(IIFNm108),并进行表达、纯化及鉴定。方法采用同源序列对比、空间结构模拟并结合α干扰素与受体结合的特点设计突变位点。用重叠延伸PCR法,扩增IIFNm108基因,与pET-23b载体连接,构建重组表达质粒pET-23b-IIFNm108,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,所得包涵体经变性、复性、DEAE阴离子交换及凝胶过滤两步层析纯化后,进行各项鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以包涵体形式存在。纯化的IIFNm108蛋白纯度大于95%,比活性约为(2.08±0.17)×108IU/mg,N-端、C-端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量为19500,可与mPEG-MAL成功交联。结论已获得一种高效且可供mPEG-MAL定点修饰的集成干扰素突变体IIFNm108。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。     

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化

目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF(high sub)疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切(NcoⅠ和XhoⅠ)和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%~15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55~6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

抗菌肽Dermaseptin S4及其突变体基因在大肠杆菌中的表达

目的构建表达抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)及其突变体K4-S4的工程菌,并表达目的蛋白。方法采用重叠延伸PCR法设计和扩增抗菌肽DS4及K4-S4基因,定向克隆入载体pUC-18中,经酶切、测序鉴定,重组至表达载体pGEX-4T-1中,构建抗菌肽DS4及K4-S4基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE鉴定。结果构建的抗菌肽DS4及K4-S4基因工程菌所表达的目的蛋白,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量34 000的特异性目的条带,37℃诱导5 h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在。结论已成功构建抗菌肽DS4及K4-S4工程菌,并表达目的蛋白,为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

SARS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中高效表达SARS核衣壳蛋白。方法将已合成的SARS-CoV N蛋白基因片段,克隆至pUC-18载体,与pET28质粒连接,转化大肠杆菌,进行SARS-CoV核衣壳融合蛋白表达。用SARS患者恢复期血清进行表达产物鉴定。用色谱方法进行表达产物的层析纯化。结果SARS病毒N基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的30%以上;经三步纯化后纯度达90%以上。结论已获得了SARS核衣壳蛋白样品。     

HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

目的　构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒 ,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件 ,同时分析其二级结构 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法　采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增 ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2 + 金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究 ,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达融合蛋白 (相对分子质量 6 5 0 0 0 ) ,其最高表达量为18 9% ,纯度大于 92 83% ,Westernblot法检测 ,能与HCVNS5b单抗反应 ,证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明 ,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论　HCV聚合酶的高效表达和纯化 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。     

蜂毒明肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。     

重组人肝细胞生长因子α在大肠杆菌中的表达及活性检测

目的　建立人肝细胞生长因子α链 (rhHGFα)高效原核表达体系。方法　以pRC/CMV hHGF为模板 ,扩增hHGFαcDNA ,继以XhoI酶切为 386和 95 4bp 2个片段 ,亚克隆入pBSKS,DNA测序后 ,将上述两个片段与pBV2 2 0连接 ,构建重组质粒。转化E .coliJM10 9、DH5α和BL2 1(DE3) ,筛选高效表达菌株。分离包涵体 ,8mol/L尿素溶解 ,梯度复性后利用反相和凝胶过滤层析纯化重组蛋白 ,经MTT法检测活性。结果　所克隆的hHGFα基因序列正确 ,筛选出高效表达菌株BY ,经SDS-PAGE显示在相对分子质量 5 2 0 0 0处出现特异的目的蛋白表达带 ,表达量约占全菌蛋白的 2 5 %。表达产物以不溶性的包涵体 (IBs)形式存在 ,复性后具有刺激原代大鼠肝细胞生长的作用。结论　已成功表达了rhHGFα蛋白 ,为研究rhHGFα结构与功能及中试生产奠定了基础。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。