基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法进行肌红蛋白的从头测序

蛋白质的序列测定对于蛋白质的鉴定具有重要意义.传统的Edman降解测序法对样品纯度有很高的要求,而且操作比较繁琐.在蛋白质组研究中广泛采用串联质谱法测定蛋白质水解肽段的部分氨基酸序列(肽序列标签),通过数据库检索来鉴定蛋白质[1,2].本工作采用反相色谱法分离肌红蛋白的酶切肽段,用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOFMS)技术测定各个肽段的氨基酸序列,拟提高蛋白质的序列覆盖率和鉴定的可靠性.     

新一代串联飞行时间质谱仪及其创新技术

MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱仪是目前最佳的工业化高通量鉴定蛋白质的技术方法,它可以对存储在样品靶上的同一样品,数秒中就可以分别获得高灵敏度的多肽质量指纹图和多肽序列信息,提高蛋白质鉴定的通量和成功率。本文将结合工作实践,力争比较全面介绍MALDI串联飞行时间质谱仪的工作原理、仪器特点、创新技术和主要应用。     

香豆素衍生物在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱测定多肽和蛋白质样品中的应用

高效基质的发现和使用能够提高基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的测定效果、扩展其应用范围.自基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)建立以来,寻找有效新基质一直都是MALDI-TOFMS研究的重要内容.目前测定多肽、蛋白质的常用基质主要是一些含苯环、羟基、氨基和羧基等官能基团的有机小分子化合物如SA和HCCA等.本工作拟设计、合成3-氨基(3-AC)、3-羟基(3-HC)、3-羧基(3-CC)和4-甲基-7-羟基香豆素(4-M-7-HC),并考察这几种香豆素衍生物作为基质应用MALDI-TOFMS测定多肽、蛋白质的结果.     

碰撞诱导解离下二甲胺衍生多肽的碎裂特征研究

串联质谱技术可以测定蛋白质酶解产物的分子质量、定位修饰位点、获取氨基酸序列信息等，已成为蛋白质组学领域的重要分析手段。鉴于酸性氨基酸能够在串联质谱分析中对多肽的裂解过程产生重要影响，本文通过二甲胺将多肽的羧基酰胺化，从而改变肽段在碰撞诱导解离模式下的碎裂特征。较未衍生多肽而言，被衍生多肽既可以产生特征性碎片离子，例如m/z 129.10/135.14,也易于产生种类更丰富的a、b、y、z离子。此外，羧基的中性化可在一定程度上抑制磷酸化多肽的中性丢失。这些特点使得基于羧基酰胺化的衍生方法有望展现在肽段表征分析方面的应用价值。     

在线纯化技术应用于MALDI-TOFMS测定溶菌酶的分子量

在用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)测定蛋白质分子量的过程中,一些盐和蛋白质变性剂经常大大抑制样品信号,产生一些难以解析的离子峰,因此测试前应尽可能去除样品中的添加剂。为此,本研究建立了MALDI—TOFMS测试中在线纯化蛋白质样品的新方法。采用硝酸纤维素膜作为固相载体,将标准蛋白质溶菌酶制成含6 mol/L盐酸胍变性剂、2％SDS表面活性剂的100 mmol/L Tris—HCL溶液进行质谱测定。结果表明:新方法简单、快速,可明显增强离子峰的强度,提高测定蛋白质分子量的灵敏度。     

基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS分析山羊角中蛋白质多肽类物质

基于shotgun混合蛋白质鉴定思路,研究山羊角水提液中蛋白质类、肽类物质组成。采用超高分辨的线性离子阱-静电场轨道阱质谱(LTQ/Orbitrap MS),从山羊角水提液中大于3ku部位鉴定出52个蛋白质,从小于3ku部位鉴定出1 288个肽段,这些肽段源于46个蛋白质。鉴定出的蛋白质主要为角蛋白、胶原蛋白、角蛋白相关蛋白等结构蛋白。根据每个氨基酸出现的频次,将蛋白质上的肽段标记,绘制热图(heat map),据此推测山羊角水提液中多肽类物质形成的过程为:从蛋白质的热区(hot regions)中经过降解、脱落、溶出,形成水提液中的各种肽段。该方法能够快速、高效地分析鉴定山羊角水提液中蛋白质肽类物质组成,可用于角类动物药蛋白质类物质组成与分析,也可为中药动物药的系统研究提供借鉴与方法参考。     

高效液相色谱法分析纯化合成肽

固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法,但是最终产物的成分往往比较复杂,不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术,高效液栩色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点,对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。     

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用鉴定椴树蜂蜜中的抗氧化活性肽

应用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用法(UPLC-Q-Exactive)鉴定椴树蜂蜜蛋白经胰蛋白酶水解后获得的肽类物质的组成和结构,并探讨椴树蜂蜜酶解多肽与其抗氧化活性的关系。椴树蜂蜜经三氯乙酸溶液沉淀,所得蛋白用胰蛋白酶酶解,酶解肽段经C18固相萃取柱富集净化后,采用0.1%甲酸(A)-乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,以高分辨质谱(Q-Exactive)的Full MS/ddMS2模式对其进行鉴定。采用MaxQuant软件分析质谱结果,所得肽段在Uniprot上进行Blast序列对比,共鉴定出52种椴树蜂蜜胰蛋白酶解多肽,其中71.15%来自蜂王浆主要蛋白(MRJPs),鉴定出的肽段归属于10种蛋白质,其中6种(60%)属于MRJP家族蛋白。对椴树蜂蜜酶解多肽质谱鉴定结果进行重复性分析,2次以上重复质谱分析可实现对椴树蜂蜜多肽(87.1%)的可靠鉴定。结合文献报道的蜂蜜多肽抗氧化活性的构效关系,筛选出11条可能具有抗氧化活性的多肽。化学合成11条多肽后,进行4种不同的抗氧化活性实验。结果表明,这11条多肽的抗氧化活性存在较大差异,其中1 g/L VIYEWK多肽显示出较强的ABTS自由基清除活性(33.8%±0.6%)、DPPH自由基清除活性(96.5%±0.0%),并表现出一定的还原力(0.010±0.001)和Fe2+螯合活性(4.0%±0.2%)。该方法能快速有效鉴定椴树蜂蜜多肽结构,可为揭示椴树蜂蜜多肽结构与抗氧化活性的关系提供依据。     

毛细管电泳技术在蛋白质、核酸研究中的应用(摘要)

高效毛细管电泳（HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，HPCE）是继色谱之后又一高效快速的分离分析技术，在80年代末成为国际上分析化学界最为活跃的研究领域之一。HPCE在蛋白质、核酸研究中的应用，特别是在脱氧核糖核酸（DNA）序列测定技术中的应用，是该研究领域中最为引人注目的分支。IHPCE在蛋白质、多肽研究中的应用1．l蛋白质、多队的纯度鉴定：作为一种高效快速的分离分析技术，HPCE为基因工程产品、人工合成多肽和诊断试剂的纯度监测以及天然活性蛋白质的纯化工艺确认提供了新的有效手段。目前已有大量的有关研究…     

两种蜘蛛多肽毒素的电喷雾电离质谱法序列分析

虎纹捕鸟蛛毒素-(HWTX-)和敬钊缨毛蛛毒素-(JZTX-)是两种蜘蛛多肽类神经毒素。它们的大部分氨基酸序列已由Edman降解法测出,但仍有部分序列由于某些原因未能确定。为了鉴定未知部分的序列,利用电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Qq-TOF-MS)对两种蜘蛛毒素的酶解产物进行分析,获得其酶解片段的一级(MS)和二级(MS/MS)图谱,在用软件和手工的方式对含有未知序列的肽段进行解析后,得到未知部分确切氨基酸序列。研究表明:利用质谱的从头测序(denovosequencing)方法获得HWTX-和JZTX-完整的氨基酸序列。该方法在蛋白质和多肽的结构分析和鉴定与传统方法相比具有高灵敏度和快速的优势,是对传统Edman化学降解法的一个很好的补充。