猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒的制备

目的制备甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,并进行验证。方法采用磁珠法从甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品中提取病毒RNA,逆转录合成cDNA。根据NCBI最新公布的大流行甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列,设计针对编码基质蛋白M基因的引物和探针,检测甲型流感病毒;设计针对血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因特异性的引物和探针,检测甲型H1N1流感病毒;同时针对人的RNaseP基因设计用于内部控制的引物和探针。所有探针均为Taqman探针,5'端标记FAM,3'端标记BHQ1。对最佳荧光PCR反应条件进行优化,在此基础上组装成甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,对其特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行验证。与市售试剂盒的检测结果进行对比,并对63份临床甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品进行检测。结果设计的PCR引物及探针能对甲型H1N1流感病毒进行准确检测,与流感病毒的其他型和亚型无交叉反应;试剂盒的灵敏度为0.004个血凝素单位;试验内变异系数小于2.5%,批间变异系数小于5%;试剂盒放置-20℃保存,稳定性良好;检测20份甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品的结果与市售试剂盒一致;检测63份流感疑似患者咽拭子样品,其中大流行甲型H1N1流感病毒阳性36份,普通甲型流感病毒阳性5份。结论所制备的甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、精密性和稳定性,可用于目前流行的甲型H1N1流感病毒的快速检测。     

TaqMan实时定量RT-PCR检测轮状病毒G4型

目的应用基于TaqMan探针的实时定量RT-PCR检测轮状病毒(Rotavirus,RV)G4型VP7基因。方法从G1、G2、G3和G4型轮状病毒Vero细胞培养物中提取病毒总RNA,分别进行RT-PCR和实时定量RT-PCR,检测引物及探针的特异性;构建含轮状病毒G4型VP7基因的质粒,制备RNA参考品,绘制实时定量RT-PCR标准曲线;验证实时定量RT-PCR的灵敏度和精密性;对5个轮状病毒G4型培养物及G1、G2和G3型各3个病毒培养物进行检测,分析其实际应用性。结果以轮状病毒G4型VP7基因引物和探针只能从G4型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增,未在G1、G2、G3型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增;在2.34×107～2.34×103拷贝/μl范围内,反应扩增效率大于90%,R2大于0.98;该方法可检出100数量级的RNA样品,且试验内及试验间变异系数分别小于2.5%和4%;用建立的实时定量RT-PCR只检出5个轮状病毒G4型样品,而G1、G2、G3型样品均未检出。结论 TaqMan实时定量RT-PCR是一种灵敏度较高、特异性和精密性良好的定量检测轮状病毒G4型的方法。     

中蜂囊状幼虫病病毒依赖解旋酶扩增检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病病毒(chinese sacbrood,CSBV)依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplific ation,HDA)检测方法,并对该方法进行优化及验证。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫RNA,以其为模板进行HDA,对建立的HDA的引物浓度(原始浓度为50μmol/L,进行10、20、40、80、160、240、320倍稀释)、反应温度(60、65及70℃)及时间(60、90及120 min)进行优化,并对优化的方法进行特异性、敏感性及稳定性验证。经电镜观察、RT-PCR及优化的HDA法对37份临床样品进行检测。结果 HDA最佳引物浓度、反应温度及时间分别为5μmol/L、65℃及90 min;CSBV与健康幼虫、蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus,ABPV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(black queen cell virus,BQCV)和残翅病毒(deformed wing virus,DWV)cDNA均无交叉反应,HDA的最低检出限为10-2ng,检测试剂保存12个月后,仍可扩增出目的条带;37份临床样品中,有6份样品的RT-PCR和HDA结果为阳性,但电镜观察仅有4份为阳性。结论建立了CSBV HDA检测方法,该方法具有较高的敏感性、特异性及稳定性,为检测其他蜂病毒及快速鉴定其他动物病毒提供了参考。     

牛副流感病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的Taq Man荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中公布的BPIV3序列,选取P基因上保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针。优化反应体系,建立实时荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、重复性和敏感性进行验证。结果标准曲线在104~108copies/μl范围内具有良好的线性关系,R~2达到0.999,斜率为-3.203,扩增效率为105.2%。利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测,结果为阳性,对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectioils bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)进行检测,结果呈阴性。3个浓度质粒标准品,重复3次检测,CV均小于1.5%。建立的方法对质粒的最小检出量为1.0×10~2 copies/μl。结论建立了能够检测BPIV3a及BPIV3c的TaqMan-MGB探针实时定量PCR方法,该方法特异性较强,重复性及敏感性良好,为早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。     

绿豆源基因的实时荧光定量LAMP检测方法研究

针对绿豆转录间隔区设计一套引物,通过温度优化、特异性和灵敏度试验,建立一种绿豆源DNA的实时荧光定量环介导等温扩增(LAMP)检测方法。结果显示,实时荧光定量LAMP检测方法在温度为61℃时,引物能够将绿豆、大豆、玉米、木薯和马铃薯DNA区分开,灵敏度可以达到0.1pg·uL~(-1)。实时荧光定量LAMP方法能够快速有效地对绿豆源成分进行检测,为绿豆制品真实性检测提供了一种快速准确的检测方法。     

吡啶并氟硼荧光染料的构建及在苦味酸识别中的应用研究

以3-吡啶甲醛和2,4-二甲基吡咯为原料,合成了吡啶并氟硼荧光染料探针mPBP。通过~1HNMR和ESI-MS进行了结构表征。在含80%DMSO水溶液中,荧光探针对苦味酸(PA)具有良好的选择性和灵敏度。探针mPBP不到30 s就能够与PA完全反应,可以快速、高效地识别PA,能够满足现场快速检测识别的要求。荧光探针mPBP与不同浓度的PA呈现良好的线性关系,最低检测浓度为12.58 nmol/L。探针mPBP成功的应用于河水样品中加标PA含量的检测,获得了很好的回收率(96.0%～105.0%)。另外,明显的溶液颜色变化(亮绿色到无色),可以作为快速可视化识别复杂环境样品中PA的化学传感器。     

自制实时定量PCR试剂在基因扩增中的效果评价

实验目的:评价自制实时定量PCR试剂在基因扩增效率上与商品化的差异,同时优化试剂配方,保证其稳定性。实验方法:1.原核表达纯化Taq DNA聚合酶,PCR确定纯化Taq DNA聚合酶的活性及在实时定量PCR中的使用浓度。2.自制实时定量PCR试剂,加入适当浓度的EvaGreen,以pAAV-LacZ质粒为模板,CMV为引物,进行实时定量聚合酶链反应,根据Ct值的变化,琼脂糖凝胶电泳,扩增曲线,溶解曲线来评估反应的灵敏度及特异性。3.调整自制的Real-time PCR mix中甘油,BSA等的浓度,在保证实时定量PCR结果准确性的情况下,尽可能的保证Taq DNA聚合酶的活性。     

矮化蓖麻RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

目的优化矮化蓖麻RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法采用正交试验设计,优化RAPD-PCR反应体系(引物、dNTP、Taq酶和Mg2+浓度)及扩增程序(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间和循环次数)。结果25μl反应体系中最佳浓度配比为:引物0.36μmol/L,dNTP0.24mmol/L,Taq酶0.05U/μl,Mg2+1.20mmol/L;最佳扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性45s,36℃退火45s,72℃延伸80s,共35个循环;最后72℃再延伸5min。结论已优化了矮化蓖麻RAPD-PCR的反应体系及扩增程序,为应用RAPD-PCR技术对蓖麻株高性状进行研究奠定了基础。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

抗戊型肝炎病毒IgG抗体定量线性标准品的标定及初步应用

目的建立抗戊型肝炎病毒(Anti-HEV)IgG抗体的定量线性标准品,并进行初步应用。方法利用抗-HEV IgG和抗-HEV IgM ELISA检测试剂筛选出1份抗-HEV IgG阳性血清L9,经基因1型和4型的HEV ORF2C-端抗原及239抗原进行Western blot确认后,用WHO定量标准品,由3个实验室协作标定,利用量反应平行线法计算其抗-HEV IgG的含量。考察已标定的L9血清的稳定性,并用所标定的1.5倍系列稀释的血清对国内外6家抗-HEV IgG试剂的灵敏度进行检测。选择一灵敏度较高的试剂,在其线性范围内取L9的5个稀释度作为抗-HEV IgG抗体定量线性标准,对高、中、低浓度的3份临床血清重复检测5次,考察其重复性;对实验感染猴的系列血清中抗-HEV IgG含量进行定量检测,考核该定量线性标准品的应用效果;并对每次定量试验中的线性方程进行分析,确定相关系数r值和斜率k值的范围。结果经国内外试剂检测筛选出的阳性血清L9与基因1型和4型的HEV ORF2 C-端抗原及239抗原均有阳性反应。经协作标定,L9血清抗-HEV IgG含量为16.9U/ml。L9血清在-20℃下保存6、12、18个月,2～8℃保存24、48、96h后,定量结果均在95%置信区间内,且抗-HEV IgG含量均未明显下降。6家抗-HEVIgG检测试剂灵敏度差异较大,范围为0.03～5.00U/ml。确定L9血清从0.42U/ml开始的5个1.5倍系列稀释度,作为某一试剂抗-HEVIgG抗体定量线性标准品。利用该线性定量标准检测高、中、低浓度的3份临床血清,定量结果重复性较好;对实验感染猴系列血清进行定量检测,结果可有效地反映抗体水平变化趋势;94%的定量检测试验,r≥0.98,1.15≥k≥0.95。结论已建立了抗-HEVIgG抗体定量线性标准品,可用于疫苗免疫原性评价和流行病学调查。     

中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。     

黑曲霉实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法。方法对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性。结果该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测,未发现有交叉反应。结论已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法。     

国内不同基因型Asia1型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立口蹄疫病毒(FMDV)Asia1型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法。方法在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asia1型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件,并进行特异性及相关病毒检测。结果优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好,检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致。结论已建立了FMDVAsia1型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。     

戊型肝炎病毒在长春地区动物群中的流行病学研究

目的分析戊型肝炎病毒(HEV)在长春地区动物群中的感染情况及戊型肝炎病毒系统进化关系。方法用抗-HEV抗体试剂盒检测长春地区猪、牛、羊、鹿、鸡和马血清中的抗体;对部分血清用RT-PCR检测HEVRNA,并对PCR阳性产物进行克隆测序及序列分析。结果493份猪血清中有427份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为86.61%;有5份为HEVRNA阳性,5株克隆的核苷酸序列的同源性为91.2%～99.1%,该5株克隆的序列在ORF2区348bp与1～4型间核苷酸同源性分别为77.8%～82.3%、77.2%～78.1%、77.2%～99.1%和85.2%～95.2%;266份牛血清中有122份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为45.86%;93份羊血清中有7份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为7.53%;798份鹿血清中有348份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为43.61%;369份鸡血清中有18份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为4.88%;197份马血清中有31份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为15.74%。结论HEV在多种动物群中均有流行,但在猪群中的流行率明显高于其他动物群。猪感染的HEV的基因序列与人群中散发性戊型肝炎病毒的基因4型同源性最高。进化关系表明,在长春地区猪与人HEV应划为一个分支。     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。