烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

陈化烟叶中纤维素降解菌群的分离及其特性研究

从陈化烟叶中分离到具有降解纤维素活性的菌群,分析了温度、pH和纤维素材料对菌群酶活性的影响,采用16SrDNA片段的PCR-DGGE（变形梯度凝胶电泳）技术分析菌群组成。结果显示,菌群主要由5种细菌组成。20℃时菌群纤维素酶活性很低,随着温度升高酶活性升高,在60℃时纤维素酶活性达到最高值,继续升温则酶活性下降。pH从3升高到8时,菌群纤维素酶活性不断增大,pH为8时酶活性达到最大,pH继续升高到9时则酶活性下降。菌群对烟叶、滤纸和烟梗中的纤维素都有降解作用,在以烟叶作为纤维素材料培养菌群时,纤维素酶活性明显高于滤纸和烟梗。陈化过程中微生物可能对烟叶纤维素有降解作用,从而影响烟叶的陈化效果;可以利用分离到的菌群在烟叶或烟梗发酵中降解纤维素,改善烟叶或烟梗的品质。     

烟叶铜锌超氧化物歧化酶的分离、纯化与性质

先用50mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)提取,再经55%~60%(质量分数)硫酸铵盐析分级分离、冷冻乙醇—氯仿沉淀除杂和丙酮再沉淀分级由成熟的K326鲜烟叶得到含CuZn-SOD的粗酶液,粗酶液经DEAE-52柱层析(20mmol/LPBS平衡洗脱6h,流速0.25mL/min;600mL20mmol/LPBS和600mL100mmol/LPBS线性梯度洗脱,流速0.25mL/min)和DEAE-52离子交换柱层析(30~100mmol/LPBS线性梯度洗脱,流速0.25mL/min),成功将3种CuZn-SOD同工酶分开;再通过G-75凝胶柱层析(10mmol/LpH7.6PBS洗脱,流速0.3mL/min)和-20℃下冷冻干燥,得到CuZnSODI和CuZnSODIII纯品,经测定,CuZnSODⅠ由302个氨基酸残基组成,其相对分子质量为36682Da,最大吸收波长262nm,最适pH6.0左右,最适温度40℃;CuZnSODⅢ含187个氨基酸残基,相对分子质量为22976Da,最大吸收波长269nm,最大荧光激发波长和发射波长分别为280和338nm,最适pH5.0~6.0,最适温度30℃。     

自然发酵烤烟叶面微生物区系的分离鉴定

分析了红大、NC89、K326 3个烤烟品种不同陈化时间的10个烟样叶面微生物的数量、种类.结果表明,在自然发酵烤烟叶面微生物中,细菌占绝对优势,放线菌和霉菌尤其是放线菌数量较少.细菌中芽孢杆菌属为优势菌群,霉菌中曲霉为优势菌群.自然发酵烤烟叶面微生物的数量和种类与烤烟品种、产地、等级和陈化时间有关.不同品种的烤烟中,优良品种烤烟叶面微生物的数量较大,种类较多.自然发酵烤烟叶面的微生物可能是推动烟叶自然发酵过程中物质转化和品质改良的生物催化剂之一.     

烟叶产香菌的分离及其在烟用香料制备中的应用

为开发新的天然烟用香料,从自然陈化的白肋烟烟叶中分离出1株能够产生特殊酸香香韵的菌株(CB-2).对该菌株进行了生理生化试验,并用该菌株液体发酵咖啡,用得到的烟用香料进行了卷烟加香试验和GC/MS分析.结果表明:①CB-2为梭菌属杆菌;②发酵咖啡中,乙酸、丁酸、十二酸、苯甲醇等成分生成,异戊酸、己酸、庚酸、癸酸、苯乙醇等成分含量增大,呋喃、5-甲基呋喃醛、十六酸、邻苯二甲酸二丁酯等成分消失,苯乙烯、苯乙醛、邻苯二甲酸二异丁酯和几种高级脂肪酸等成分含量明显降低;③发酵香料具有提高卷烟烟气香气质,增大香气量,降低干燥感和刺激性,柔和烟气的作用.     

烟叶醇化过程中烟碱降解菌的分离鉴定与特性分析

从醇化烟叶中分离到具有降解烟碱活性的菌群(Q6),16S rDNA片段的PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析显示,菌群由8种细菌组成.从菌群Q6中分离出1株烟碱降解菌D1,经菌落形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens).在低温(20℃)、偏酸或偏碱(pH=5或者pH≥9)及高烟碱浓度(＞1g/L)条件下,菌群Q6均表现出比单菌D1更强的降解活性.烟叶发酵和加入静息细胞试验表明,菌群和单菌均可降解醇化烟叶中的烟碱.在菌群和单菌的烟碱代谢产物中都检测到烟碱烯、2,3’-联吡啶和可替宁.结果显示:醇化过程中烟叶表面微生物可能对烟碱有降解作用,从而影响烟叶的醇化效果,可以利用分离到的菌群或单菌在烟叶醇化过程中降解烟碱,以改善烟叶品质;同时也可以利用烟碱降解菌处理烟草废弃物中的烟碱.     

甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

以新鲜甘薯老叶为材料,经过匀浆、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex-200凝胶层析等步骤后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得了电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）,纯化后ACP比活力为251.49 U/mg,纯化了169.07 倍,回收率为3.50%。酶学性质研究结果表明：ACP为单亚基酶,全酶分子质量为42.3 kD,单亚基分子质量为41.2 kD;最适反应温度65 ℃,最适pH 5.2;在40 ℃以下和pH 4.0～6.0范围内酶活性较稳定;以对硝基苯磷酸二钠为底物时,测得其米氏常数Km值为0.258 mmol/L;Ca2+和Mg2+对ACP酶活性有明显激活作用,K+和Li+对ACP酶活性无影响,甲醇、乙二胺四乙酸和草酸对ACP酶活性的抑制作用较大;Hg2+和Ag+对ACP酶活性的抑制作用非常明显。     

香菜叶多酚氧化酶的分离纯化与部分酶学性质研究

新鲜香菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的多酚氧化酶。该酶比活力达到5 622.95 U/mg,酶活回收率为3.90%,纯化倍数为126.08;全酶分子质量为111.10 kD,亚基分子质量为55.60 kD;最适温度为37 ℃,最适pH值为6.5;在25～45 ℃及pH 6.0～7.0范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为4.04×10－2 mol/L;甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2＋、Hg2＋、Ba2＋对其有抑制作用,Co2＋、Pb2＋对其具有一定的激活作用。     

烟叶原料中主要非烟物质的成因分析

统计分析了2005-2011年某烟叶挑选场的非烟杂物种类及含量。结果表明,非烟杂物以人工合成类杂物含量最高,推测主要来源于采收之后的有关环节。下部叶的杂物含量显著高于上部叶。在采用帆布包装的烟叶原料中,非烟杂物含量显著低于麻片包装,说明改进包装方式有益于防治杂物混入烟叶。值得注意的是,近年来,非烟杂物的含量大幅度降低,表明烟农和管理人员的质量意识和管理水平显著提高。     

蕹菜叶酪氨酸酶的分离纯化与部分性质

蕹菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的酪氨酸酶。该酶活力达到114.53 U/mg,酶活力回收率为11.33%,纯化倍数为99.59。全酶分子质量为77.60 kD,亚基分子质量为38.70 kD;最适温度为45 ℃,最适pH值为7.5,该酶在25～55 ℃及pH 6.0～8.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为10.05 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2+和Pb2+对该酶有抑制作用,Mn2+、Zn2+和Co2+对该酶具有一定的激活作用,尿素和十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfonate,SDS）对该酶活性影响不大,Li+、K+对该酶活性基本没有影响。     

三乙膦酸铝在烟叶及土壤中的降解规律研究

烟叶及土壤中残留的农药三乙膦酸铝,经碱解生成乙醇气体,以叔丁醇做内标,顶空进样,气相色谱(FID)测定乙醇含量,据三乙膦酸铝对乙醇的转化率,推知三乙膦酸铝残留量.结果表明,三乙膦酸铝在烟叶和土壤中平均添加回收率超过84.0%,相对标准偏差小于8.50%,方法最低检出浓度鲜烟叶和土壤中0.01 mg/kg,干烟叶中0.05 mg/kg;在烟叶中消解速率较快,半衰期2.44～3.14 d,在土壤中消解速率相对较慢,半衰期6.20～8.98 d;最后一次施药后21 d,三乙膦酸铝最终残留量在烟叶中低于0.68 mg/kg,在土壤中低于0.31 mg/kg.方法灵敏度和添加回收率符合农药残留分析要求.