免疫磁珠分离技术在食源性致病菌检测中的应用

免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子, 由载体微球和免疫配基结合而成。免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beads separation techniques, IMBS)则是利用免疫磁珠上包被的特异性抗体与抗原发生亲和反应, 从复杂的样品中分离到目标抗原。再利用磁珠的磁响应性, 实现对目标抗原的富集。在食源性致病菌检测方面, 该技术通过与其他检测手段相结合而得到广泛应用, 具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优势。本文综述了免疫磁珠的结构特点、免疫磁珠分离技术的原理, 着重阐述了该技术在食源性致病菌检测方面的应用进展, 以期为免疫磁珠分离技术的广泛应用提供参考。     

全自动免疫磁珠分选系统检测沙门氏菌

目的研究全自动免疫磁珠分选系统对国标沙门氏菌检测方法的改进效果。方法从肉鸡专项监测中选取106份样品,采用全自动免疫磁珠分选系统和GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门菌检验》进行沙门氏菌对比检测。与国标法相比,全自动免疫磁珠分选系统取消了SC和TTB增菌,经BPW增菌后直接使用系统富集目标菌并接种显色平板。结果免疫磁珠法阳性检出率为32%,国标法阳性检出率为31%,二者无显著性差异(P0.05)。但磁珠法取消了二次增菌的步骤,检测时间比国标法节省24 h,且平板上的单个菌落生长率和菌株特异性也更好。采用磁珠法检测的106份样品中,有34份样品检出可疑显色菌株,都有单个可疑菌落生长,最后均鉴定为目标菌沙门氏菌;采用国标法有38份样品检出可疑显色菌株,其中3份无单个可疑菌落生长经再次转种,最后有5株经鉴定为嗜水气单胞菌等干扰性杂菌,仅33株为目标菌沙门氏菌。结论全自动免疫磁珠分选系统特异性好、单个菌落生长率高且检测时间短,可以用于食品中沙门氏菌检验。     

免疫磁珠检测食品中单增李斯特菌的研究

免疫磁珠技术因其具有操作简便、高效快速等特点,目前已被广泛地应用于食品的快速分离纯化和检测领域中。本研究建立了单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的免疫磁珠(Immune magnetic beads)检测方法,实现对单增李斯特菌的快速检测。通过对单增李斯特菌免疫磁珠添加量、免疫磁珠与菌液最佳反应时间、免疫磁珠分离单增李斯特菌的敏感性试验、特异性试验的研究,确定了单增李斯特菌抗体添加量50μg/mL、免疫磁珠添加量100μL,免疫磁珠与菌液最佳作用时间为30min。结果表明免疫磁珠法可快速特异地检测出食品中单增李斯特菌,检测灵敏度底限为10-7,相应的细菌浓度为14cfu/mL。该方法反应灵敏度高,特异性强,大大节省了检测时间和费用,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测。因此研究食品中单增李斯特菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生,具有重要的现实意义。     

基于免疫磁珠的胶体金免疫层析法快速检测水产品中地西泮残留

本研究针对水产品中地西泮残留的问题,建立了一种快速、灵敏的免疫磁珠-胶体金免疫层析法。采用链霉亲和素磁珠与生物素化地西泮单克隆抗体偶联制备的免疫磁珠,快速富集、分离水产品中地西泮残留,并结合胶体金免疫层析法进行半定量检测。结果表明,经过优化后试剂卡最佳工艺为金标抗体标记量25 μg/mL、T线抗原包被量0.6 mg/mL、C线羊抗鼠二抗包被量1.5 mg/mL、金标喷量3.0 μL/cm,地西泮加标浓度为1.0、5.0、10.0和15.0 μg/kg时回收率为78.34%~90.40%,相对标准偏差(RSD)为5.03%~8.96%。本方法特异性强、稳定性好,可在25 min内完成单个样本检测,对水产品中地西泮残留检出限为0.5 μg/kg,优于常规前处理法。经验证,对40份水产品样本检测结果与GC-MS法结果一致,证明免疫磁珠-胶体金免疫层析法可作为水产品中地西泮残留快速检测的有效手段。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。      

免疫磁珠分离技术在病原微生物检测中的应用

本文综述了免疫磁珠分离技术的基本原理、主要影响因素及其在病原微生物检测领域中的应用,重点介绍了该技术与传统的分离培养技术、PCR技术、免疫学技术联合使用后,可以更有效地分离各种标本中的病原体,提高实验室对致病微生物的检出率,缩短检测时间,为病原体检测提供了一种新的技术路线.     

免疫磁珠技术分离检测熟制食品中的蜡样芽孢杆菌

目的 建立一种免疫磁珠技术分离富集熟制食品中的蜡样芽孢杆菌。方法 在一定量的蜡样芽孢杆菌体系中优化免疫磁珠与抗体用量以及最佳反应时间。在最佳实验条件下, 对免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的敏感性和特异性进行实验, 并对实际熟制食品的蜡样芽孢杆菌进行分离。结果 最终确定了蜡样芽孢杆菌抗体添加量50 μg/mL、免疫磁珠添加量100 μL, 免疫磁珠与菌液最佳作用时间为15 min, 当菌液稀释度达到10?7, 免疫磁珠法仍然可以检出, 相应的细菌数为4 CFU/mL。结论 本实验制备的免疫磁珠技术灵敏性高, 特异性好, 节省了检测时间和费用, 适用于食品中的蜡样芽孢杆菌的检测。     

免疫磁珠法检测脱水蒜制品中沙门氏菌

研究免疫磁珠法用于出口脱水蒜制品中沙门氏菌的检测,将免疫磁珠使用于400mL大体积溶液中,并使用高速离心代替磁棒进行分离。致病微生物捕获、分离实验结果表明免疫磁珠法具有特异性强、灵敏度高的特点,沙门氏菌污染量为1CFU/25g时,检出率为70%,污染量为10CFU/25g时,检出率达100%。     

免疫磁珠捕获结合荧光PCR 技术检测食品中黄曲霉菌的研究

目的：研究利用免疫磁珠对食品中黄曲霉菌进行捕获的技术,为检测食品中污染的黄曲霉菌提供新方法。方法：应用山羊抗黄曲霉菌血清的免疫磁珠捕获食品中的黄曲霉菌,不需要进行增菌培养,应用磁捕获- 荧光聚合酶链式反应(IMC-FPCR)技术快速检测鉴定食品中的黄曲霉菌。结果：IMC-FPCR 方法检测黄曲霉菌的最低检测值为2CFU/mL。应用IMC-FPCR 对从市场上购买的12 种食品进行检测,发现有两份样品含有产毒素相关基因(即为可能的致癌菌株),检出率为16.7%,其中花生中检出1 株黄曲霉菌,面线中检出1 株黄曲霉菌。结论：建立了黄曲霉菌的磁捕获- 荧光聚合酶链式反应(IMC-FPCR)方法,该方法可用于食品中黄曲霉菌的快速检测及鉴定,实物检测结果提示市场上食品有被真菌污染。     

免疫磁珠捕获-通用引物PCR快速检测食品中致病菌的研究

为了提高食品中致病菌的检出率和灵敏度,利用免疫磁珠捕获结合经典PCR技术建立免疫捕捉通用引物PCR(IMC-UPPCR)检测食品中的致病菌.结果显示,采用细菌16SrRNA基因保守区设计特异性引物,建立通用引物PCR技术是可行的,IC-UPPCR检测致病菌的最低检测限可达10 cfu,检测致病菌的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现.采用本方法与国标方法分别对50种不同样品进行3种致病菌检测,结果显示两种方法的符合率达100%,特异性相当.与国标方法相比,本方法灵敏度更高,并具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,可以满足大批样品致病菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫等领域.     

基于免疫磁珠快速分离金黄色葡萄球菌的研究

通过实验优化建立基于免疫磁分离技术对金黄色葡萄球菌的快速分离方法,为后续快速检测提供基础.利用金黄色葡萄球菌多抗制备的免疫磁珠对其捕获.结合平板菌落计数,考察包被磁珠时多抗加入量、免疫磁珠加入量及捕获时间等因素对捕获效率的影响.在单因素实验基础上进行正交实验,并对该方法的灵敏度、特异性及其在食品中的应用效果初步探索.结果表明,最佳捕获条件为抗体加入量30μL,免疫磁珠加入量80μL,捕获时间45min,在此条件下捕获效率均超过30％,该方法捕获限可达到101CFU/mL,特异性良好,并初步用于羊肉卷洗水中金黄色葡萄球菌的快速分离,捕获时间小于1h.免疫磁分离作为一种快速的分离筛选方法,可用于食源性金黄色葡萄球菌的快速分离.     

酶解大豆分离蛋白的抗原活性变化及其抗原表位分析

研究酶解过程中大豆蛋白分子成分和抗原性变化规律及酶解物中是否存在抗原表位序列。用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白后,首先分别用电泳和酶联免疫法分析蛋白质分子组分和抗原活性变化,结果发现,酶解过程中新生成23 ku和21 ku抗酶解肽链直到酶解120 min时仍未消失,同时酶解物中剩余28%抗原活性。进一步通过胰蛋白酶对这两个肽链胶内酶解并用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪分析后,将所得肽段氨基酸序列分别与抗原数据库中抗原表位序列和大豆分离蛋白氨基酸序列进行匹配解析,结果发现,在21 ku组分中含有两个完整的序列抗原表位（LQRFNQRSPQLQNLR和SEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKN）,且均来自β-伴大豆球蛋白中的α-亚基,21 ku组分抗原剩余率为15.7%;在23 ku肽链中含有抗原表位的部分氨基酸序列,但未发现含有完整的抗原表位序列,23 ku组分抗原剩余率为2.1%,该组分中是否含有新的未知抗原表位或是否与糖链有关尚待深入研究。上述研究结果揭示了大豆蛋白酶解物中仍残留抗原性的部分原因。     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

基于免疫磁珠快速分离金黄色葡萄球菌的研究

通过实验优化建立基于免疫磁分离技术对金黄色葡萄球菌的快速分离方法,为后续快速检测提供基础。利用金黄色葡萄球菌多抗制备的免疫磁珠对其捕获。结合平板菌落计数,考察包被磁珠时多抗加入量、免疫磁珠加入量及捕获时间等因素对捕获效率的影响。在单因素实验基础上进行正交实验,并对该方法的灵敏度、特异性及其在食品中的应用效果初步探索。结果表明,最佳捕获条件为抗体加入量30μL,免疫磁珠加入量80μL,捕获时间45min,在此条件下捕获效率均超过30%,该方法捕获限可达到101CFU/mL,特异性良好,并初步用于羊肉卷洗水中金黄色葡萄球菌的快速分离,捕获时间小于1h。免疫磁分离作为一种快速的分离筛选方法,可用于食源性金黄色葡萄球菌的快速分离。      

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合实时荧光PCR(real time PCR)快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR(IMS-real time PCR)方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×10~1 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×10~2 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×10~2CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。     

双烯雌酚免疫抗原的合成与鉴定研究

本实验旨在合成和鉴定双烯雌酚(DEN)免疫抗原,通过双烯雌酚的酚羟基与琥珀酸酐反应,合成半抗原双烯雌酚-琥珀酰半酯(DEN-HS),采用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联制备免疫抗原(DEN-BSA)经紫外光谱分析和动物免疫试验证实免疫抗原合成成功,问接酶联免疫法分析证明其免疫鼠所获得的抗体与双烯雌酚有良好的特异性.实验成功合成了双烯雌酚免疫抗原,并获得了高效价的免疫血清,研究结果为免疫分析方法的进一步研究提供了试验基础.     

国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。     

粮食中黄曲霉毒素B1检测的免疫磁珠法样本前处理应用研究

采用免疫磁珠净化法对小麦、玉米等样品进行样本的前处理分析研究,完成多种样品基质的净化和富集,随之利用高效液相色谱法对样品中的黄曲霉毒素B1含量进行检测分析.为了验证免疫磁珠法快速提取的可行性,在相同的实验条件下采用免疫亲和柱完成对样品提取,对比两种净化方式对样品检测结果的差异性,结果表明两种提取方式的检测结果误差在可接...