生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(CPP)的研制

摸索了 2 70 9碱性蛋白酶水解酪蛋白制备CPP的最佳工艺条件 :底物浓度 1 0 %、用酶量 1 50 0U/g底物、反应温度 45℃、pH1 0 5、反应时间 1 50min。采用选择淀淀法分离CPP ,在pH 4 .5添加 1 1 ?Cl2 (w/v)和50 % (v/v)乙醇 ,室温沉淀 4h,得到CPP产品的N/P、得率分别为 6 39和 1 3 94%。     

响应曲面法优化酪蛋白磷酸肽的制备

采用Plackett-Burman设计法和响应面分析法相结合,以CPP（酪蛋白磷酸肽）得率作为指标,进行碱性蛋白酶水解酪蛋白的条件优化。结果表明,底物浓度、温度和pH是影响CPP得率的主要因素。最佳水解条件为温度55℃、底物浓度16%、pH10.8、酶底比1.5%,水解时间4.5h,在此条件下,CPP得率可达33.2mg/mL。      

酪蛋白磷酸肽(CPP)理化特性的研究

研究了CPP的溶解性、起泡性及乳化性。CPP在pH2.0～10.0范围内,溶解性除在pH4.0约为90％外,其它均高于90％,且随pH增加而增大。与酪蛋白相比,CPP具有更好的起泡性和泡沫稳定性。CPP对热及Ca²⁺具有较好的稳定性。CPP乳化力较酪蛋白下降约20％,乳化性下降2.89％,乳化稳定性下降1.45倍。      

一株食源性单增李斯特菌镉、砷耐受基因的测序分析

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,CPP）是以牛乳酪蛋白为原料,含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽。本文通过比较两种不同氮磷摩尔比（N/P）的CPP样品抑制钙离子形成沉淀的功能以及pH值、温度和CPP浓度对其的影响,并与柠檬酸和木糖醇的协同作用进行比较研究。结果表明：CPP浓度是CPP作用效果的主要影响因素,pH值对CPP影响较大,其次是柠檬酸和木糖醇的添加。温度对CPP作用效果几乎没有影响;柠檬酸和木糖醇与两种CPP之间都有一定的协同作用并且两种CPP与柠檬酸的协同作用效果接近。且浓度越高,效果越好。在抑制金属离子沉淀,pH、CPP浓度和木糖醇协同作用上CPPⅡ的作用效果较好,但温度对其两者都没有影响。两种CPP样品都具有良好的功能性质,但氮磷摩尔比（N/P）低的CPPⅡ性质更优。本试验为我国研究开发富含CPP的功能性食品以及营养保健食品提供理论基础。     

肽钙螯合物的研究进展

利用酪蛋白磷酸肽螯合钙离子的特性,以钙离子浓度为尺度,分级制取不同钙螯合能力的CPPs,同时提高其纯度。以酪蛋白的胰蛋白酶酶解产物为原料,通过逐级增加Ca²⁺添加量,在终浓度为55%（v/v）的乙醇溶液中分级沉淀出三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分（CPP1-Ca、CPP2-Ca和CPP3-Ca）,并利用PBS脱钙得到三个级分相应的酪蛋白磷酸肽（CPP1、CPP2和CPP3）。以传统钙乙醇沉淀法得到的肽钙螯合物（CPP-Ca）为对照,分析并对比三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分的理化性质以及持钙特性。结果表明,三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分中,CPP3-Ca含有最高的纯度和钙螯合量,分别为89.42%和69.59 mg/g,明显高于未分级CPP-Ca的83.77%和55.05 mg/g。氨基酸组成及N/P（摩尔比）分析发现CPP3-Ca含有更高磷酸丝氨酸基团,进而能够结合更多的Ca²⁺。不同酪蛋白磷酸肽级分持钙能力分析结果显示CPP3能够更好地延迟和阻止磷酸钙沉淀的形成,具有更高的持钙能力。同时CPP3-Ca在模拟肠道环境中具有更高的钙溶解度,表明分级后的酪蛋白磷酸肽-钙螯合物的体外生物利用度提高。

     

Fe3O4@ZrO2磁纳米粒子在酪蛋白磷酸肽富集中的应用

本实验将制备好的Fe₃O₄@ZrO₂磁性纳米粒子作为载体,对经胰蛋白酶消化后的酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides,CPP）进行高效地选择性富集。实验以CPP的N/P（摩尔比）以及磁纳米粒子吸附量为评价指标,进行单因素实验以便选取较优的实验因素,分析酪蛋白水解度、吸附pH、吸附时间、吸附温度及肽溶液初始浓度这五个因素对Fe₃O₄@ZrO₂磁性纳米粒子选择性吸附CPP的能力的影响,优化CPP富集的技术参数。结果表明,磁性材料最佳富集工艺系数为:酪蛋白的水解度为22%,反应pH=4.5,吸附温度为30 ℃,吸附时间为50 min,肽溶液初始浓度为50 mg/mL;在此条件下,可得到N/P（摩尔比）为4.87的CPP,磁纳米粒子的吸附量为94.37 mg/g,且用NaOH(pH13)溶液进行解析,CPP的洗脱率可达95%以上。综上,Fe₃O₄@ZrO₂磁性纳米粒子呈现出优异的选择性富集CPP的潜力,对高质量高纯度CPP 的生产具有重要的指导意义。     

毛细管区带电泳测定酪蛋白磷酸肽方法的研究

用毛细管区带电泳(CZE)对酪蛋白磷酸肽(CPP)进行了分离和测定。研究出的适宜电泳操作条件为:工作电压30KV、柱温25℃、毛细管长度50cm、内径70μm、进样量5sec(气压进样)、紫外检测波长200nm、缓冲液pH值9.2测定不同N/P样品的CPP含量分别为42.2％、50.0％、51.0％。     

高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

目的建立高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)测定婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide, CPP)的含量的方法。方法对样品静置温度、静置时间、沉淀分离方式进行优化,用高效液相色谱法对婴幼儿配方奶粉中CPP的含量进行测定。结果最优的前处理条件为样品溶解后调整pH至4.6,于4℃条件下静置1 h,过滤后上清液经0.22μm滤膜过滤,以Ultimate AQ-C_(18)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)分离。经钼蓝比色法鉴定,保留时间为8.387min的组分为CPP。该方法在10～1000mg/L范围内线性关系良好,相关系数为0.9993,定量限为4.40 mg/L,婴幼儿奶粉中添加量为500、1000、5000 mg/kg时, CPP的回收率为96.63%%～101.42%。结论该方法样品前处理简单,稳定性和可靠性良好,检测结果符合定性定量要求,可用于婴幼儿配方奶粉中CPP含量的测定。     

离子交换法制备酪蛋白磷酸肽

分别用阴离子树脂和阳离子树脂对酪蛋白磷酸肽（CaseinPhosphopeptide,简称CPP）初级品N/P(摩尔比r为7.52)进行纯化.采用阴离子树脂纯化CPP的回收率为P98.71％;N82.78％;高纯度CPP产品的r(N/P)为5.44.对阳离子树脂纯化CPP做了初步探讨,研究了不同pH对纯化效果的影响.在pH5.0的最优条件下,回收率P为81.85％,N为53.80％,r(N/P)为4.67.与阴离子树脂纯化CPP的过程相比,用阳离子树脂纯化CPP时,树脂在使用前无需转型处理,洗脱条件简单,从而大大地缩短了操作时间,并且提高了产品的浓度.     

酪蛋白磷酸肽(CPP)促进铁吸收的研究

体外消化试验表明CPP能显著提高FeCL_3溶液中Fe~(3+)的溶解性(P<0.01),并显著促进Fe~(3+)还原为Fe~(2+)(P<0.05),上述作用受CPP浓度和纯度影响较大,受pH值影响不显著(P>0.05)。加入CPP使可溶性铁和二价铁的透析率均显著高于对照组(P<0.01)。CPP与Fe~(3+)结合能力受磷酸基密度、浓度影响较大,受pH值影响不显著(P>0.05)。     

酪蛋白的转谷氨酰胺酶酶促糖基化交联条件及产物性质

在氨基葡萄糖存在的条件下,利用转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)对酪蛋白进行糖基化交联修饰。以修饰酪蛋白产物中氨基葡萄糖的导入量为指标,采用单因素试验分别考察反应体系pH值、酶添加量、反应温度和时间对修饰反应的影响。优化后的适宜修饰条件为:酪蛋白底物质量浓度为30g/L,氨基葡萄糖添加量为3mol(每kg酪蛋白中)、pH值为7.5、酶添加量为10kU(每kg酪蛋白中)、反应温度为37℃、时间4h。与酪蛋白和转谷氨酰胺酶促交联的酪蛋白相比,修饰酪蛋白产物的乳化性质和胶凝性质得到显著改善,并且体外消化性能未受到影响,表明转谷氨酰胺酶催化的糖基化交联修饰可以用于改善酪蛋白的这些功能性质。     

Observations of casein micelles in skim milk concentrate by transmission electron microscopy

The microstructure of casein micelles in ultrafiltrated (UF) skim milk concentrate at pH 6.5 and 5.8 was investigated by transmission electron microscopy using three different preparation methods. The volume fraction of the casein micelles in the UF concentrate was 62.8% (v/v) at pH 6.5 and fixation by glutaraldehyde revealed the close packing of micelles in the UF concentrate as well as a higher degree of micelle aggregation at pH 5.8. No details of the microstructure of the micellar surface or core could, however, be observed. Freeze-fracture of cryoprotected, i.e. glycerol, UF concentrate on the other hand, exposed the finer structures of the micellar core but no pH dependent differences were observed. As cryoprotection includes a dilution of the sample with glycerol, the packing of the micelles in the UF concentrate could not be observed. Undiluted UF concentrate exposed to rapid freezing using a propane jet followed by freeze-fracture exhibited development of ice crystals but rough areas on the micrographs were identified as fractured casein micelles. The micellar core appeared rougher and differences in the micellar core microstructure due to changing pH could be observed when this preparation method was used.     

酪蛋白磷酸肽(CPP)对生长期大鼠骨密度的影响

探讨4种不同酪蛋白磷酸肽（CPP）的不同CPP/Ca比值对生长期大鼠骨密度的影响.选用4周龄雄性SD大鼠,按体重随机分为低钙组、补钙组和CPP加钙实验组（A,B,C,D四种CPP按CPP/Ca比值为1,2,4,分别设低、中、高3个剂量组）,以灌胃方式给予补钙和CPP,12周后处死大鼠,取双侧股骨,称重,计算股骨指数;化学法测骨钙,双光能X线吸收法测骨密度.结果表明,4种CPP三个剂量组和补钙组大鼠骨密度均显著高于低钙组（P＜0.01）,其中C种CPP高剂量组的骨密度显著高于补钙组（P＜0.05）,其余各组CPP的骨密度也高于补钙组,但差异不显著.C种CPp在CPP/Ca比值为4时能显著促进大鼠钙的吸收和利用,提高股骨骨钙含量,增加骨密度,其他3种CPP增加骨密度的作用不显著.     

市售两种酪蛋白磷酸肽产品持钙能力的比较

对市售两种酪蛋白磷酸肽(CPP)产品体外结合钙离子的能力(即持钙能力)进行了测定和比较，结果表明CPP产品在弱碱性溶液中能有效抑制和延缓Ca3(PO4)2沉淀的产生，且在相同条件下，纯度越高，N／P值越低的CPP产品持钙能力越强。本文还讨论了在产品研发过程中如何选用CPP产品。     

酪蛋白磷酸肽的体外功能试验

对不同级别的酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide,以下简称CPP）促进钙吸收的体外功能性质进行了研究,测定了CPP的结合钙量、CPP阻止磷酸钙沉淀形成的效果及持钙能力.结果表明CPP对钙的结合量随温度的升高而减少,随pH值的升高而增加;CPP对阻止磷酸钙沉淀的作用随温度升高和溶液钙磷比增加而下降;随氮磷摩尔比降低,CPP阻止磷酸钙沉淀形成的最低有效浓度下降;对于不同的钙磷比,CPP的氮磷摩尔比越小,保持在溶液中的钙量越多,但每摩尔磷保持钙的摩尔数随氮磷摩尔比的降低而降低.     

Properties of casein micelles cross-linked by transglutaminase

Factors affecting the cross-linking of milk proteins by transglutaminase (TGase) were studied. Cross-linking of caseins in bovine skim milk was optimal over a very wide pH range. The role of micellar calcium phosphate (MCP) in maintaining the integrity of TGase-treated casein micelles was studied by incubating skim milk with 0.01% (w/v) TGase at 30°C for 1–24 h, followed by removal of MCP from untreated or TGase-treated milk by acidification and dialysis. The protein content and profile of the samples were determined by Kjeldahl and SDS-PAGE, respectively. Whey proteins in unheated milk were not susceptible to TGase-induced cross-linking. The higher level of sedimentable protein in MCP-free TGase-treated milk than in MCP-free control milk indicated that TGase treatment partially prevented disintegration of the micelle on removal of MCP, probably due to extensive intramicellar TGase-induced cross-linking of casein molecules which led to the formation of sedimentable covalently bonded casein aggregates.     

酪蛋白磷酸肽的质量评价方法研究

对来自8种不同公司的酪蛋白磷酸肽(CPP)产品的含量、体外结合钙离子的能力(即持钙能力)用不同的测定方法进行了测定和比较,采用氮磷比(N/P)、钡乙醇沉淀法测定样品含量,用pH滴定法和钙离子选择电极法测定了8种样品的体外持钙能力。研究结果表明:当酪蛋白磷酸肽含量较低时选用N/P和钡乙醇沉淀法测定结果偏差较大,应选用高效液相色谱法(HPLC);pH滴定法和钙离子选择电极法两种方法都能在一定程度上反映样品体外持钙能力的大小,但用pH滴定法测定的结果更符合产品含量的测定结果。本文为CPP开发过程中的质量评价提供了一定的依据。     

Changes in the apparent viscosity profiles of casein suspensions as affected by plant enzymes

The aim of this work was to study the degree of hydrolysis and changes in the apparent viscosity of casein suspensions as a result of various enzymes addition. Suspensions with 3, 12 and 15 g/100 mL of casein, at pH 5.2, 6.0 and 6.5 were prepared in buffer solutions. Previous standardization; plant (papain and bromelain) and animal (chymosin) enzymes were added to hydrolize the casein suspensions. A control with no enzyme addition was used. The rheological behaviour was determined using a rotational rheometer (Haake RV20), with a cone and plate geometry. The Casson and the power law equations were applied to the data. The degree of hydrolysis was a function of the enzyme, pH and casein concentration, presenting chymosin the highest values. All enzymes showed the highest activity at acidic pH. Also, some substrate inhibition was observed. All samples behaved as non-Newtonian, shear-thinning systems with a yield stress value. In all cases, a significant increase in the viscosity was observed when shifting from 3 to 12 g/100 mL. Further increase in concentration caused an opposite effect. Changes in pH of the casein suspensions affected the viscosity, presenting maximum values at pH 6.0. The Casson equation fitted the results better than the power law model.