海巴戟天(诺尼)果内生细菌的初步分离与鉴定

首次对采自我国海南三亚市诺尼植物果实内生细菌进行初步分离与鉴定研究,相关研究为诺尼果内生菌研究奠定基础。采用传统微生物学分离培养方法对28℃培养条件下分离得到的15株细菌进行16S rDNA扩增和系统发育分析。研究表明,分离得到的15株诺尼果内生细菌分属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)3个类群,包括甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)和链霉菌属(Streptomyces sp.)7个属的11个已知种。研究结果表明,诺尼果中内生细菌具有较为丰富的多样性,获得了一批应用前景广泛的诺尼果内生细菌资源。     

西沙野生诺尼果内生菌的分离与鉴定

采用传统微生物学分离培养方法对我国海南西沙野生诺尼果内生菌进行分离与鉴定研究。计数结果显示,成熟野生诺尼果内生菌菌落总数达1.0×105CFU/g,其中真菌总数为8.0×103CFU/g。进一步在25²8℃下分离得到22株细菌、14株酵母菌和9株霉菌,分别采用16S rDNA、26S rDNA D1/D2区和ITS rDNA序列进行扩增和系统发育分析。结果表明,(1)22株内生细菌分属于α变形菌纲(α-Proteobacteria)、β变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ变形菌纲(γ-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)5个类群,包括亚西亚菌属(Asaia sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、短小杆菌属(Curtobacterium sp.)、藤黄色杆菌属(Luteibacter sp.)8个属的10个已知种;(2)14株酵母分属于担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota),包括隐球酵母菌属(Cryptococcus sp.)、Pseudozyma sp.、Sympodiomycopsis sp.和假囊酵母属(Eremothecium sp.)4个属的5个种;(3)9株霉菌均属于子囊菌门(Ascomycota),包括枝孢属(Cladosporium sp.)、轮层炭菌属(Daldinia sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、Nemania sp.和青霉属(Penicillium sp.)5个属的5个种。     

广西烟草内生细菌的动态分布及其对烟草疫霉的拮抗作用

从广西百色市的9个烟草品种中分离出470株内生细菌菌株,经常规细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析,获得的菌株分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotro-phomnas)和假单胞菌属(Pseudomonas),其中土壤杆菌属和肠杆菌属为烟草内生细菌中的优势种群。烟草内生细菌的类群和数量随烟草种植地点、品种、器官和生育期的不同而不同。烟草内生细菌在根部数量最多,其次是茎和叶。内生细菌的总量从缓苗期到旺长期增加,之后显著下降。从470株烟草内生细菌菌株中筛选出对烟草疫霉有拮抗作用的菌株56株,其中芽孢杆菌菌株Y10的抑制效果最好,抑制率达91.48%,室内盆栽防治效果为68.72%。     

新疆特色药食同源植物恰玛古内生细菌的分离与筛选

通过传统微生物培养方法对我国新疆恰玛古内生细菌进行分离及筛选,共得到48株内生细菌,分为7个OTUs,经形态学观察、16S rDNA扩增及系统发育分析,将其归为厚壁菌门(Firmicutes)中的芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、放线菌门(Actinobacteria)中的微杆菌属(Microbacterium sp.)和变形菌门(Proteobacteria)中的噬脯氨酸菌属(Prolinoborus sp.)。这是国内外首次对我国新疆特有的药用植物恰玛古内生细菌进行分离筛选的研究。     

黄酒酒曲中产生物胺细菌的分离鉴定

为探明黄酒酒曲中产生物胺细菌的菌相,深入研究黄酒中的生物胺形成机制,分别以4种黄酒酒曲(麦曲M、麦曲L、小曲Q、红曲H)为研究对象,采用脱羧酶培养基对产生物胺细菌进行初筛,高效液相色谱法复筛,并通过16S rDNA基因序列分析,对分离得到的产生物胺细菌进行鉴定。共筛选出42株产生物胺细菌,包括肠杆菌属(Enterobacter sp.)17株,乳杆菌属(Lactobacillus sp.)6株,克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)5株,沙门氏菌属(Salmonella sp.)4株,肠球菌属(Enterococcus sp.)3株,克罗诺菌属(Cronobacter sp.)3株,埃希菌属(Escherichia sp.)菌株2株,柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)1株,葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)1株。分离的产生物胺细菌中多数可同时产生多种生物胺,其中产腐胺、尸胺、组胺的菌最多,但未分离到色胺和亚精胺产生菌。     

宁波地区传统梅干菜中优势发酵菌株分离鉴定及酶活分析

以宁波地区梅干菜半成品和成品为试验材料,采用十倍稀释法分离其中优势发酵菌株,从半成品中得到7株细菌,分别命名为MGCB1～MGCB7,从成品中得到3株细菌,分别命名为MGC1～MGC3。通过形态学观察、生理生化试验及16S rRNA序列分析对菌种进行鉴定,结果表明,MGCB1～MGCB7分别为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)、空气芽孢杆菌属(Bacillus aerius)、高山芽孢杆菌属(Bacillus altitudinis)、短小芽孢杆菌属(Bacillus pumilus)、琥珀葡萄球菌属(Staphylococcus succinus)、琥珀葡萄球菌属(Staphylococcus succinus)和解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens),MGC1～MGC3分别为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus halodenitrificans)、哥特氏芽孢杆菌属(Cytobacillus gottheilii)。MGCB1和MGCB7产酶能力相对较高,在37℃培养96 h后,蛋白酶活...     

天山一号冰川沉积层低温脂肪酶产生菌的筛选及初步鉴定

从新疆天山一号冰川西支尾部的底部沉积层中分离筛选出高产低温脂肪酶菌株,进行初步鉴定及产酶探讨。使用罗丹明-B、吐温80、维多利亚蓝选择培养基以及三丁酸甘油酯酶活检测板,结合棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)比色法,筛选出产低温脂肪酶酶活较高的菌株,研究其生长特性及常规生理生化实验,并根据16S rRNA基因序列初步确定其所属菌属。共分离筛选到5株产低温脂肪酶酶活较高的菌株,经初步鉴定其中4株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),1株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。该芽孢杆菌属产脂肪酶的能力略高于其余菌株。分离得到的5株菌均属于耐冷菌,有较好的耐盐性,能在低温条件下发酵产酶,其中4株在36h左右达到产酶高峰,为开发冰川环境下丰富的低温酶资源奠定了基础。     

海洋源蛋白酶产生菌筛选及酶学特性的初步研究

从海洋源鱿鱼中筛选高产蛋白酶菌株。通过检测蛋白酶产生水解圈结合蛋白酶活性测定的方法筛选高产蛋白酶菌株,采用PCR技术对筛选菌株进行16S rRNA鉴定,并构建目的菌株的系统发育树,同时研究粗蛋白酶的酶学特性。结果表明:筛选得到的10株产蛋白酶活力较高的菌株,经鉴定分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。其中SW5菌株产酶活性最高达257.67±2.44 U/mL,为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株所产粗蛋白酶的酶学特性研究发现,其最适pH为8.0,最适温度为40℃,终离子浓度为1 mmol/L时Mn2+、Ba2+和Ca2+对该蛋白酶活性有较高的激活作用,而Fe~(2+)和Zn~(2+)能明显抑制该蛋白酶活性。     

水晶肘花长白斑现象的微生物分析

为了探索肘花长白斑的原因,分别从正常和长白斑的肘花产品中分离纯化得到14株菌,传统培养和16S rDNA的综合分析结果表明,对照组中的细菌主要为泛团菌属(Pantoea sp.)和包括Enterobacter cloacae、Enterobacter ludwigii 在内的肠杆菌属(Enterobacter sp.);而白斑组中除了肠杆菌属外,还分离出包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在内的芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.),由此推断芽孢杆菌的存在可能是引起产品变质的主要原因.     

烤烟品种K326内生细菌分离、抗黑胫病菌株筛选及种群组成分析

从烤烟品种K326的不同生长时期分离内生细菌1000株,以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)为靶标,共筛选出168株拮抗菌,这些内生细菌对黑胫病菌的抑菌率在12.54％～50.14％之间.苗期和团棵期的内生菌含量较高,但在开花和成熟期时降低了一个数量级,而拮抗菌数量呈上升趋势.对168株拮抗菌的16SrRNA基因序列进行RFLP分析,共产生10种带型.根据RFLP带型选取39株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析.结果表明,这168株生防内生细菌归于2大类群:Firmicutes和Actinobacteria.Firmicutes类群中的芽孢杆菌属(Bacillus)是优势属,共6种RFLP带型,150个菌株,包括Bacillus amyloliquefaciens subsp,plantarum,Bacillus tequilensis,Bacillus methylotrophicus,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis和Bacillus aryabhattai. Bacillus amyloliquefaciens subsp,plantarum和Bacillus methylotrophicus的出现频率最高,共126株,占该属总菌株数的78.75％.其余18个菌株分属于4个种:即Brevibacillus formosus,Brevibacillus parabrevis,Pseudomonas umsongensis和Pseudomonas aeruginosa.     

云南重楼内生细菌的分离鉴定及系统发育树分析

利用云南文山采集的人工栽培和野生云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch)根茎,对其内生细菌进行了分离、纯化及鉴定。分离得到40和44株云南重楼内生细菌。经16S rDNA测序,在NCBI中比对,MEGA4建系统进化树,所得内生细菌分别鉴定为分属于6和8个属。其中,人工栽培云南重楼内生细菌中,芽孢杆菌属(Bacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)分离频率分别为35%、27.5%,是其优势内生细菌群;野生云南重楼内生细菌中,芽孢杆菌属(Bacillus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)分离频率分别为36.4%、20.4%,是其优势内生细菌群。本研究结果体现了人工栽培和野生云南重楼内生细菌分布的差异及云南重楼根中内生细菌的多样性,也为后续重楼内生菌的多样性开发提供了理论和实验基础。     

酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌的系统发育分析和胞外酶学特征

从酒鬼酒窖池中采集成熟酒醅样品,用纯培养法进行芽孢杆菌分离纯化,采用16S rRNA基因序列分析法进行系统发育分析,采用水解法对其胞外酶学特征进行观察。采用NA和LA培养基分离纯化得到104株细菌菌株,根据形态特征和产芽孢特征,去除部分冗余,选择28株代表性芽孢杆菌用于进一步研究。系统发育分析结果表明,这28株芽孢杆菌具有较高的类群多样性和物种多样性,属于细菌域(Bacteria)厚壁菌门(Firmicutes)的2个科(Bacillaceae、Paenibacillaceae)的3个属(Bacillus、Brevibacillus、Virgibacillus),分为10个物种。芽孢杆菌属(Bacillus)占绝对优势,共26株(92.9%);其余2株JSM161009和JSM 166025分属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。胞外水解酶学特征观察结果表明,至少产生一种酶的菌株共27株(96.4%)。其中有20株(71.4%)淀粉水解酶阳性,19株(67.9%)明胶水解酶阳性,27株(96.4%)尿素水解酶阳性,21株(75.0%)对4种吐温(20、40、60、80)之一水解活性阳性。在28株受试菌株中,有8株(JSM 161009、163010、163017、166014、167011、167021、168017、168019)水解酶谱较广。这8个菌株均属于芽孢杆菌科(Bacillaceae),其中1株(JSM161009)属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus),其他7株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。     

基于高通量测序和可培养方法的勐海发酵普洱茶细菌多样性分析

以勐海地区百中堂茶厂发酵普洱茶为研究对象,采用高通量测序技术,并结合传统可培养方法,对普洱茶从晒青毛茶原料到发酵完成过程中9个时间节点的细菌多样性进行了研究。结果表明,普洱茶发酵过程中细菌多样性丰富。高通量测序数据分析到61个属,212个OTU,发酵前期以欧文氏菌属(Erwinia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)为主,而发酵中、后期芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)及小短杆菌属(Brachybacterium sp.)为优势菌群稳定存在。通过可培养方法,从发酵过程中分离到细菌18个属,30个种,优势菌属包括微杆菌属(Microbacterium sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、小短杆菌属(Brachybacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等。     

芽孢杆菌TF18的鉴定以及系统发育分析

目的对一株透明质酸酶高产菌株进行鉴定及系统发育分析。方法收集本公司空气沉降菌分离得到一株产透明质酸酶细菌TF18,对此菌株进行鉴定及系统发育分析。利用细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,以获得该菌株的16S rDNA基因序列,并进行序列分析及系统发育分析;结合其形态特征、培养特征、生理生化特征,确定其种属。结果菌株TF18菌体杆状、好氧、产芽孢,应属于芽孢杆菌属,生理生化实验及系统发育分析结果也表明,此菌株属于芽孢杆菌属,但又不同于该属的其他已知菌种,故判定为新种。结论从自然界筛选得到的透明质酸酶高产菌株Bacillus sp.TF18为芽孢杆菌属一新种,为开发利用此菌种生产制备透明质酸酶及寡聚透明质酸(o-HA)提供了理论基础。     

牡蛎共附生可培养微生物多样性的研究

研究牡蛎共附生真菌和细菌的种群多样性。通过牡蛎内生菌群分离、形态学观察、生理生化鉴定及16S r DNA/18S r DNA序列分析等试验,分析牡蛎共生菌的优势种群,并对分离菌的发酵粗产物进行初步成分分析。结果分离获得32株内生细菌,全部属于γ-变形菌纲,其中微球菌和芽孢杆菌为牡蛎内生细菌的优势菌属;分离获得20株内生真菌,分别属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和无性型真菌类(Anamorphic Fungi)中的10个属,其中青霉属和曲霉属为牡蛎内生真菌的优势菌属,占分离总数的40%。发酵液粗产物的薄层层析结果表明牡蛎内生菌的发酵产物成分丰富。研究结果表明牡蛎共附生真菌和细菌具有丰富的种群多样性。     

库车小白杏内生细菌多样性及其产酶特性

分析采后库车小白杏果实内生细菌多样性,挖掘潜在的微生物资源及功能。利用高通量测序法对采后库车小白杏内生细菌结构组成进行分析,同时,采用传统分离培养法对内生细菌进行分离筛选,并对所获得的菌株进行16S rRNA基因序列分子鉴定,进而对相关菌株的产酶特性进行分析。高通量测序结果显示,采后库车小白杏内生细菌共包括406个操作分类单元,涉及9个门,94个属。其中,拟杆菌属(Bacteroidetes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和未分类菌群等物种多样性最为丰富。通过分离筛选共获得99株菌,分别归属于放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)4个菌门的28个属。同时,获得7个未在高通量测序结果中检出的属类群,发现潜在新种5个。实验获得了一批蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶产生菌。本研究的开展为深度挖掘库车小白杏果实中的潜在微生物资源及相关酶制剂的筛选和研制提供丰富的材料,同时,也为从微生物角度揭示小白杏腐败变质等研究提供新思路。     

不同地区小曲中可培养细菌的筛选及鉴定

以湖北、安徽和四川地区小曲为研究对象,利用传统培养方法和分子生物学方法研究不同地区小曲中可培养细菌的种类。结果表明,湖北小曲pH值为5.35,含水量为9.93%,密度为0.87 g/mL,共分离出8株可培养细菌,其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）6株,泛菌属（Pantoea spp.）及丰年芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）各1株;安徽小曲pH值为5.60,含水量为12.33%,密度为0.84 g/mL,共分离出5株可培养细菌,其中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）3株,埃希氏菌属（Escherichia spp.）及枯草芽孢杆菌（B. subtilis）各1株;四川小曲pH值为5.59,含水量为9.41%,密度为0.92 g/mL,共分离出7株可培养细菌,其中枯草芽孢杆菌（B. subtilis）2株,B. toyonensis、普城沙雷氏杆菌（Serratia plymuthica）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）及Burkholderia fungorum各1株。不同地区小曲中可培养细菌种类差异较大,但3种小曲均有芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。     

黄粉虫内生菌的分离鉴定及其对淀粉、纤维素和木质素的降解活性的测定

目的 分离培养黄粉虫体内细菌, 并测定这些菌对淀粉、纤维素及木质素的降解活性。方法 对黄粉虫表面消毒, 以LB和高氏一号培养基分离虫体内部细菌并进行16S rRNA基因序列分析。变色圈法测定降解活性。结果 共分离到8株细菌, 16S rRNA基因序列分析表明, 1株属于肠球菌属, 3株属于乳酸球菌属, 2株属于芽胞杆菌属, 另2株属肠杆菌属。水解酶测定结果表明, 菌株FJAT-18107具有淀粉和木质素水解作用, 其16S rRNA基因序列与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens (NR_075005)最相似。结论 本研究为了解昆虫内生菌功能提供了参考。     

冷海水保藏下鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)菌相变化规律及优势腐败菌的分离鉴定

以冷海水保鲜的鲐鱼为研究对象,通过选择性培养基和16S r DNA序列分析法探究其在冷海水保鲜过程中的菌相变化,确定了鲐鱼在冷海水保鲜条件下的优势腐败菌,并通过MEGA5.2软件构建了贮藏末期代表菌株的系统发育树。结果表明:冷海水保鲜鲐鱼样品在贮藏初期(第0 d)的微生物比较复杂,优势种群是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和嗜冷菌属(Psychrobacter sp.),还有少量的类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌属(Brevibacterium sp.);随着贮藏时间的延长,鲐鱼样品中的菌相逐渐变的单一,假单胞菌属迅速下降,希瓦氏菌属迅速增加;贮藏末期希瓦氏菌属和肠杆菌属(Enterobacter sp.)的比例迅速增加,其中希瓦氏菌属呈上升趋势且到贮藏后期数量占绝对优势,被确定为鲐鱼冷海水保鲜条件下的优势腐败菌。     

低盐腌制大头菜腐败菌的分离与初步鉴定

以低盐腌制大头菜为原料,对贮藏、流通期间主要腐败微生物进行分离鉴定。利用微生物学传统分离培养方法从腐败的真空包装低盐腌制大头菜中分离得到菌落形态差异明显的7株细菌、2株酵母。对细菌菌株进行革兰氏染色,同时提取细菌和酵母菌纯培养物基因组DNA,分别进行16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列PCR扩增。测序结果与NCBI中已知序列进行比对和鉴定,发现5株为Bacillus属,1株为Lysinibacillus属,2株为Candida属,1株为非培养细菌的同源菌。经系统发育分析,菌株X5和Lysinibacillus sphaericus的相似性为97%,其余菌株分别与Bacillus sp.,Bacillus subtilis,Bacillus megaterium,Bacillus boroniphilus,Bacillus gibsonii,Uncultured bacterium,Candida pararugosa,Candida zemplinina的相似性为99%~100%。通过微生物生理特性研究及腐败现象分析,推断芽孢杆菌和酵母可能是引起腌制大头菜腐败变质的主要原因。