牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

半套式PCR检测牛奶中单核细胞增生性李斯特氏菌

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, LM)对牛奶等食品均有不同程度的污染,[1]低温冷藏时仍可存活并繁殖使人致病甚至死亡,[2]是食品中的重要病原菌,被列为九十年代食品中4大病原菌之一.     

志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制

根据志贺氏菌ipaH基因序列设计了特异引物和探针,并对Taq 酶、Mg2 和引物探度等反应条件进行了优化.结果表明用实时荧光PCR法检测志贺氏茵具有特异性强、灵敏度高等突出的优点,可应用于进出口检验检疫、食品安全检测、疾病控制等领域.     

食品中志贺氏菌检测技术研究进展

志贺氏菌是主要的食源性致病菌之一,其低感染剂量和严重危害性受到人们广泛关注。因此,探究出快速、灵敏、高效的志贺氏菌的检测方法,对于保障食品质量安全是至关重要的。志贺氏菌的检测方法可分为三大类:传统培养方法、免疫学方法和分子生物学方法,许多研究为使其在样品检测中更加实用,进行了不同程度的改进。本文综述近年检测志贺氏菌的技术,包括改良的传统方法、免疫学方法和分子生物学方法以及新兴检测方法。重点阐述这些方法的应用范畴和应用进展,为志贺氏菌检测方法的选择提供参考。     

TaqMan探针双重荧光PCR技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的 建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法 通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果 该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×102 cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(R2)均大于0.999。结论 本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。     

基于内参的志贺氏菌实时荧光定量PCR快速检测

根据Genbank已公布的志贺氏菌基因组序列,筛选特异性靶基因ipa H,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应过程。按照人工污染样品,以评价所建立反应体系的性能。以志贺氏菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/u L;以10倍梯度稀释的菌液用水煮法提取DNA为模板,最低检测限为9×103CFU/m L;以含有ipa H的质粒为模板,最低检测限可以达到103考贝/u L;建立ipa H和ipa H-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999);人工污染初始菌量为20 g中10 CFU的羊肉时,志贺氏菌在增菌6 h后即可检出(水洗加试剂盒法)。作者建立的ipa H-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中志贺氏菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,进一步保证了结果的可靠性,有利于实现样品中志贺氏菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

乳饮料中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GeneBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测,菌液敏感度可达到2cfu／mL,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测乳饮料中志贺氏菌的需要。     

肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法

肉制品中致病菌DNA的提取对PCR检测具有重要意义。以污染志贺氏菌的猪肉为材料,比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS法、改良的碱性异硫氰酸胍法4种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果,并以提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明:改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好,猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5×100CFU/g,整个检测时间<8h。经改良的碱性异硫氰酸胍法操作简便、经济省时,可用于肉类的PCR检测。     

Rapid detection of bovine milk in yak milk using a polymerase chain reaction technique

Yak milk contains a greater percentage of protein and has better quality than bovine milk. There has been an increasing focus on yak milk and milk products during the last few years. In the present study, a PCR-based assay was developed for the specific identification of bovine milk in yak milk by designing 3 primers targeting the mitochondrial ND1 gene. The use of 3 primers in a single PCR reaction set yielded 2 amplification fragments of 293 and 190 bp from bovine milk DNA, whereas only 1 amplification fragment of 293 bp was obtained in yak milk DNA. The technique was applied to raw and heat-treated binary mixtures of yak and bovine milks and enabled the specific detection of bovine milk with a detection limit of 0.1%. The assay developed is sensitive, fast, and straightforward, and it might be useful in the quality control of yak milk and milk products.     

实时荧光PCR法和国标法检测乳粉中单增李斯特菌的比较研究

目的 提升实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的速度和准确性。方法 依据《GBS4789.30-2016S食品安全国家标准S食品微生物学检验S单核细胞增生李斯特氏菌检验》和能力验证作业指导书对食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行检测, 同时利用实时荧光PCR法对能力验证中的2个样品进行快速筛查,采用VITEK2 Compact30全自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌落。结果 GB 4789.30国标法和实时荧光PCR快速筛查法检测,结果均为样品CODE:FC02220028单核细胞增生李斯特氏菌阳性, 样品CODE:FC02220098阴性。结论 本实验室参加了中国食品药品质量检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证,取得了满意的结果。     

Rapid detection of cows' milk in sheeps' and goats' milk by a species-specific polymerase chain reaction technique

A polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the specific identification of cows' milk in sheep's and goats' milk by using primers targeting the mitochondrial 12S rRNA gene. The use of a forward primer complementary to a conserved DNA sequence, along with a reverse primer specific for cow, yielded a 223-bp fragment from cows' milk DNA, whereas no amplification signal was obtained in sheep's and goats' milk DNA. The technique was applied to raw, pasteurized, and sterilized milk binary mixtures of cow-sheep and cow-goat, enabling the specific detection of cows' milk with a good sensitivity threshold (0.1%). The proposed PCR assay represents a rapid and straightforward method applicable to the authentication of milk and other dairy products in routine analysis.     

Fast real-time polymerase chain reaction for quantitative detection of Lactobacillus delbrueckii bacteriophages in milk

One of the main microbiological problems of the dairy industry is the susceptibility of starter bacteria to virus infections. Lactobacillus delbrueckii, a component of thermophilic starter cultures used in the manufacture of several fermented dairy products, including yogurt, is also sensitive to bacteriophage attacks. To avoid the problems associated with these viruses, quick and sensitive detection methods are necessary. In the present study, a fast real-time quantitative polymerase chain reaction assay for the direct detection and quantification of L. delbrueckii phages in milk was developed. A set of primers and a TaqMan MGB probe was designed, based on the lysin gene sequence of different L. delbrueckii phages. The results show the proposed method to be a rapid (total processing time 30 min), specific and highly sensitive technique for detecting L. delbrueckii phages in milk.     

副溶血弧菌PCR检测方法研究进展

副溶血弧菌是引起包括我国在内的世界各地沿海地区食物中毒的重要食源性致病菌,患者有典型的肠胃炎症状。及时准确地对食品中的副溶血弧菌进行检测是预防该菌引起的食物中毒的关键。分子生物学检测方法在副溶血弧菌检测中具有许多优势,现已得到广泛的应用。本文对PCR检测方法中的多重PCR、有扩增内标的PCR、实时荧光PCR(包括荧光染料法和荧光探针法)、基于DNA染料叠氮溴化乙锭和叠氮溴化丙锭的PCR、纳米粒子PCR、免疫捕获PCR、PCR-变性高效液相色谱、PCR-酶联免疫吸附等方法的国内外研究情况进行了综述,并对其检测效率、灵敏度、优点和缺点等进行了分析比较,环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)——包括常规LAMP和原位LAMP因与PCR方法有相似之处,故一并进行了综述,为副溶血弧菌PCR检测方法的应用与开发提供参考。     

免疫磁球捕获-PCR检测牛奶中金黄色葡萄球菌的研究

对免疫磁球捕获-PCR(IMS-PCR)检测牛奶中金黄色葡萄球菌进行了初步研究。优化了免疫磁球制备参数,确定了金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的结合时间。研究结果显示,当纯菌浓度为101~104CFU/m L水平时,金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的捕获率大于80%。通过对目标菌和非目标菌的检测,IMS-PCR检测方法显示了很强的特异性;在纯培养、无需增菌情况,IMS-PCR检测方法检测限为104CFU/m L;牛奶中的金黄色葡萄球菌经磁分离后增菌2h用PCR检测,可检测出104CFU/m L的金黄色葡萄球菌。     

免疫磁球捕获-PCR检测牛奶中金黄色葡萄球菌的研究

对免疫磁球捕获-PCR（IMS-PCR）检测牛奶中金黄色葡萄球菌进行了初步研究。优化了免疫磁球制备参数,确定了金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的结合时间。研究结果显示,当纯菌浓度为101¹04CFU/m L水平时,金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的捕获率大于80%。通过对目标菌和非目标菌的检测,IMS-PCR检测方法显示了很强的特异性;在纯培养、无需增菌情况,IMS-PCR检测方法检测限为104CFU/m L;牛奶中的金黄色葡萄球菌经磁分离后增菌2h用PCR检测,可检测出104CFU/m L的金黄色葡萄球菌。      

A duplex polymerase chain reaction for the quantitative detection of cows’ milk in goats’ milk cheese

A duplex polymerase chain reaction (PCR) has been applied for the detection of both cows’ and goats’ milk in goats’ milk cheeses using primers targeting the mitochondrial 12S rRNA genes. By means of a linear normalised calibration curve between the log of the ratio of the cows’ band intensity and the sum of cows’ and goats’ intensities vs. the log of cows’ milk percentage, it was possible to quantify cheese adulteration with cows’ milk in the range of 1–60%. The duplex PCR technique allowed the detection of 0.1% of cows’ milk in goats’ milk cheese. The proposed method was successfully applied to cheeses with defined amounts of cows’ milk and to 15 of a total of 17 commercial cheese samples. The results showed the fraudulent addition of cows’ milk in three samples labelled as pure goats’ milk cheeses and the omission of goats’ milk mentioned on the label of two cheeses containing mixed milk.     

真鲷虹彩病毒聚合酶链式反应检测方法的建立

目的:真鲷虹彩病毒一直都被列入在世界卫生组织（OIE）水生动物疫病病原的名录中,故需要对其检测方法进行深入研究,建立操作简单,普遍适用的检测技术手段。方法:本文针对RSIV片段设计了一对特异性引物,对反应体系和反应程序进行筛选和优化,建立了检测RSIV聚合酶链式反应的方法。并且用优化好的反应体系和反应程序对重组质粒p MD18-T-RSIV进行扩增。结果:研究发现该方法特异性强,与IHNV、IPNV、SVCV和VHSV无交叉反应,并且灵敏度高,可以达到0.2pg。结论:成功的建立了真鲷虹彩病毒常规PCR检测方法,可以为真鲷虹彩病毒病的诊断提供理论依据。