氟西汀快速免疫检测用人工抗原的合成与鉴定

本文针对药物、减肥类保健食品中氟西汀成分及残留问题现状,主要研究了氟西汀人工抗原的合成方法,并对所合成的半抗原、人工抗原进行了结构和特异性鉴定。研究中先将氟西汀与丙烯酸甲酯反应后再经过水解制备出半抗原(H-FXT),再用活泼酯法将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了氟西汀人工免疫原(H-FXT-BSA)和氟西汀包被原(H-FXT-OVA),通过免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA方法对抗血清进行了鉴定评价。研究制备的人工抗原H-FXT-BSA、H-FXT-OVA经紫外光谱扫描计算后偶联比分别达到14.5:1和11.3:1。免疫小鼠后所获得抗血清的效价均达到30000以上,半抑制量浓度IC50值为100 ng/m L。本研究首次合成了鉴定氟西汀人工抗原,并成功获得了氟西汀抗体,本研究可为后期在药物、减肥类保健食品中氟西汀成分的免疫快速检测方法的建立和酶联免疫检测试剂盒等相关产品开发奠定了关键技术研究基础。     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

两种司帕沙星完全抗原的合成鉴定及免疫效果研究

目的:用两种方法合成司帕沙星人工抗原,并制备相应的鼠源多克隆抗体。方法:用混合酸酐法和DCC法将半抗原SPFX与BSA偶联制备免疫原SPFX-BSA,通过DCC法制备人工包被原SPFX-OVA,采用紫外光扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定与分析。免疫小鼠后,采用间接ELISA法测定多抗血清效价,阻断ELISA,鉴定其抑制价和特异性。结果:UV和SDS-PAGE鉴定结果初步表明SPFX人工抗原成功合成;动物试验表明,4只小鼠多抗血清效价均在3.2×104以上,其中1号小鼠IC50值为163.87 ng/mL,与其他竞争物无明显交叉反应,抗体特异性良好。结论:两种偶联方法均能成功合成人工抗原,制备出鼠源抗SPFX多克隆抗体,其中混合酸酐法能明显提高完全抗原的合成和免疫效果。     

呋喃西林代谢物多克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

为了建立检测呋喃西林代谢物(SEM)的酶联免疫吸附分析方法(ELISA),将所设计合成的系列半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原并免疫新西兰大白兔,筛选获得源于新颖半抗原H3的具有高亲和力、高特异性抗SEM多克隆抗体。同时,基于设计合成的系列同/异源包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA灵敏度的影响,发现H4-OVA作为异源包被原建立SEM的ELISA检测方法可获得最佳的检测效果,结果显示:ELISA方法的半抑制浓度(IC50)为12.37ng/mL;定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.439～110.78ng/mL;检测限(IC10)达0.07ng/mL,达到了国内外相关检测限量要求,可应用于实际食品样品检测。     

杀菌剂抑霉唑人工抗原的合成和鉴定

以咪唑乙醇为原料,与6- 溴己酸乙酯发生取代反应后再经水解反应合成抑霉唑半抗原(6-[1-(2,4- 二氯苯基)-2-(1- 咪唑基)乙氧基]己酸)。产物经薄层层析和1H-NMR 鉴定后,采用活化酯法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联得到免疫原(HIA-BSA)和包被原(HIA-OVA),紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为13:1 和7:1,初步说明人工抗原合成成功。通过免疫动物获得效价为1:64000 的抗体,采用间接竞争ELISA 法测定抗体的IC50 值为1.76μg/mL,从而进一步证明人工抗原合成成功,所得的抗体可用于ELISA 检测试剂盒的研制。     

格列本脲人工抗原的合成与鉴定

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用对氨基苯甲酸法制备半抗原,将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过碳二亚胺法偶联制备免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA),利用紫外扫描进行抗原的化学鉴定,通过免疫原免疫Balb/c小鼠,间接酶联免疫吸附法测定抗血清进行生物鉴定。结果：制备了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原,经紫外光谱扫描,偶联比分别为4:1和17.7:1。免疫小鼠后获得抗血清的效价均达到32000以上,半抑制质量浓度为10μg/mL。结论：成功合成了格列本脲人工抗原,并获得了格列本脲抗体,为格列本脲的免疫学检测方法进一步研究提供了实验基础。     

呋喃唑酮人工抗原的制备与鉴定

为了制备3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的完全抗原,作者以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料,首先合成了3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),然后通过对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生制得3-(4-羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ),以CPAOZ作为半抗原,经水溶性碳化二亚胺法(EDC),缩合酯化法(DCC)和混合酸酐法(MA)法3种方法分别与载体蛋白偶联,合成人工抗原。对于制备产物通过紫外光谱扫描分析进行了鉴定,3种抗原的偶联比率分别为8、12、17。采用3种抗原做为包被原,建立了酶联免疫(ELISA)抑制曲线。结果表明,对AOZ的半数抑制率(IC50)分别为12.9、7.6、1.1 ng/mL。采用混合酸酐法(MA法)制备的包被抗原与抗体具有较好的匹配性。3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物,采用本试验制备的抗原,有望获得特异性更好的抗体。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

苄嘧磺隆人工抗原的合成与鉴定

以2-甲酸甲酯苄磺酰胺和琥珀酸酐为原料合成半抗原(hapten),经薄层层析和1H-NMR鉴定后,采用混合酸酐法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联获得免疫原(hapten-BSA)和包被原(hapten-OVA),紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为8:1和13:1,初步说明具有较好免疫原性。通过动物免疫实验获得了效价达1:32000的阳性血清,采用间接酶联免疫吸附检测(ELISA)法检测抗体的IC50和IC10值为0.5032mg/L和0.0024mg/L,表明人工抗原合成成功。     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

酶联免疫吸附测定法检测白条鸭表皮组织中的脱氢松香酸

通过优化抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数及二抗稀释倍数等参数,建立白条鸭表皮组织中脱氢松香酸（dehydroabietic acid,DHAA）含量的间接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法。白条鸭表皮组织中的DHAA用甲醇提取,经磷酸盐缓冲液稀释,使用酶标板进行检测。结果表明：最佳抗原包被质量浓度为1.0 μg/mL,最佳抗体稀释倍数为1∶6400,最佳二抗稀释倍数为1∶10000;ELISA方法的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20150.0 ng/g;在100～5000 ng/g添加量范围内,DHAA回收率为78.2%～97.2%;实际样品分析结果显示,市场流通领域中白条鸭表皮组织中DHAA的检出率达到87%,含量范围为118.6～1199.2 ng/g。     

胶体金标免疫固相膜检测动物性食品中氟甲喹

氟甲喹(flumequine,FLU)是动物专用的抗生素,滥用或超标使用会造成动物性食品中的残留问题,对人类健康造成危害。以活泼酯法制备氟甲喹完全抗原,免疫新西兰大耳白兔获得抗血清,通过间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗血清的效价和亲和性,效价为1∶12 800,纯化后抗体的IC50达到0.055 ng/mL。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,并用于标记FLU多克隆抗体制备免疫金。以硝酸纤维素膜为固相载体,包被上包被原和酶标二抗作为检测线和控制线,优化检测条件:封闭液为5%脱脂乳、酶标二抗稀释40倍、包被量1.0μg、免疫金稀释度1∶5(体积比)、金标抗体与待测溶液混合比例1∶5(体积比)。在最优条件下,制成FLU胶体金标记免疫固相膜,最低检出限达40μg/L。建立的胶体金标记固相膜免疫检测方法适于大量样品的快速定性筛查。     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

环丙氨嗪完全抗原的合成及免疫原性鉴定

目的合成并鉴定环丙氨嗪(cyromazine,CA)人工抗原。方法采用碳二亚胺法(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)将环丙氨嗪与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联;采用紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry,UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和动物免疫对人工抗原进行鉴定。经过4次免疫,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价,间接竞争ELISA测定血清灵敏性。结果 UV法和SDS-PAGE法结果初步显示半抗原环丙氨嗪和载体蛋白偶联成功;小鼠血清效价均在1:6400以上,2号小鼠多抗血清半数抑制浓度IC_(50)为27.5 ng/mL。结论本研究成功合成了环丙氨嗪的人工抗原,为环丙氨嗪单克隆抗体制备奠定基础。     

沙丁胺醇直接竞争ELISA 法快速测定

建立沙丁胺醇的直接竞争ELISA(dcELISA)快速检测方法,采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体,棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数,通过单因素试验,考察反应体系中表面活性剂、离子浓度、甲醇体积分数、pH 值因素对dcELISA 性能的影响,确定最优检测条件,同时考察方法的特异性。结果表明：酶标抗体克分子比为2.1 时偶合物的滴度最高,最佳反应条件为包被抗原质量浓度1μg/mL,酶标抗体稀释2560 倍,0.01mol/L、pH7.4 的磷酸盐抗体稀释液(PBS)中含体积分数0.05% 的Tween-20、0.5mol/L NaCl溶液和体积分数5% 的甲醇时dcELISA 具有最高的灵敏度和最好的稳定性,所建立方法的IC50 为10.3ng/mL,检测限为0.049ng/mL,线性范围0.3～76.30ng/mL,批内变异系数13.8%,批间变异系数为22.38%,与克伦特罗交叉反应率为321.18%,与溴布特罗交差反应率为29.09%,与其他结构类似物没有明显交叉反应。本研究所建立的dcELISA 可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测。     

基于噬菌体展示纳米抗体的绿色免疫PCR检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的：在获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）抗独特型纳米抗体的前期基础上,将纳米抗体作为酶标抗原的替代物,应用于荧光定量免疫聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）体系,实现DON的高灵敏、绿色免疫分析。方法：将特异性结合DON抗体的噬菌体展示纳米抗体（P-28）作为竞争抗原,以编码P-28纳米抗体的DNA为靶标,设计特异性PCR扩增引物,优化荧光定量免疫PCR退火温度、抗DON抗体浓度、P-28投入量等参数,建立基于间接竞争模式的荧光定量免疫PCR检测DON的方法。结果：本研究建立的荧光定量免疫PCR方法线性检测范围为0.1～1 000 ng/mL,IC50值为（3.96±2.21）ng/mL,最低检出限为0.048 ng/mL,并与其他真菌毒素无交叉反应。结论：该方法直接使用噬菌体展示纳米抗体作为竞争抗原的替代物,应用于免疫PCR体系,避免了使用传统的化学合成酶标抗原所带来的环境污染、操作毒性等缺陷,并具有良好的特异性及灵敏度。     

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃 西林代谢物

目的建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay,BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数,通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse Immunoglobulin G,Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间,建立标准曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果最佳实验条件为:包被原稀释倍数为1:800,单克隆抗体稀释倍数为1:12800,SA-HRP稀释倍数为1:8000,封闭液为1%的脱脂乳,竞争反应时间为30 min,Biotin-IgG孵育时间为30 min,SA-HRP孵育时间为60 min,显色时间为15 min;在优化条件下,线性方程为Y=-0.3299X+0.4272(r~2=0.990),IC_(50)为0.601ng/m L,线性范围为0.074~4.883 ng/m L;加标回收率为88.8%~98.5%,批内变异系数(coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%,建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内。结论 BA-ELISA法灵敏度高、特异性好、重现性好,可适用于动物组织中呋喃西林代谢物的快速筛查。     

间接竞争化学发光酶联免疫分析法检测番茄酱和果汁中异细交链孢菌酮酸

针对番茄酱和果汁中链格孢霉菌毒素污染问题,建立异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,ITe A)间接竞争化学发光酶联免疫分析法。通过棋盘法和单因素试验确定最佳包被原质量浓度为15.6 ng/m L、抗体质量浓度为稀释96 000倍、缓冲体系pH 7.4、竞争反应时间和二抗反应时间分别为40 min和50 min。方法IC50为2.13 ng/m L,线性范围为0.50~9.12 ng/m L,检测限为0.10 ng/m L,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%,样品添加回收率在78.60%~110.83%之间,变异系数均小于15%。本方法适用于样品中ITe A污染的特异性快速筛查。     

化学发光酶联免疫法检测苏丹红Ⅰ

为检测食品中苏丹红Ⅰ残留,建立间接竞争化学发光酶联免疫分析（chemi luminescent enzymeimmunoassay,CLEIA）法。通过优化包被抗原中本抗原与载体物质的量比、包被抗原质量浓度、抗体稀释比例,建立竞争抑制曲线。线性范围为0.156～5 ng/mL,最低检测限为0.078 9 ng/mL,IC50为0.679 ng/mL。CLEIA回收率为75.08%～112.18%,变异系数为8.89%～15.61%;通过与酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法进行比较,在相同抗原抗体质量浓度条件下,CLEIA法测定的IC50较ELISA方法降低30%,具有较高的灵敏度。