扇贝异源四倍体诱导后代的细胞遗传学研究

采用50mg/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)处理15min抑制栉孔扇贝(Chlamys farreri♀)×虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis♂)异源受精卵第一极体的释放诱导扇贝异源四倍体.采用基因组荧光原位杂交技术(GISH)结合染色体滴片技术对扇贝异源四倍体诱导后代的染色体遗传构成进行研究,对授精后17～66h内6个时间段各300多个分裂相进行统计分析.结果表明,诱导异源四倍体过程中产生了多种倍性的幼虫,包括5.192%的四倍体、16.577%的三倍体以及单倍体、二倍体、五倍体和大量的非整倍体.在17～66h内同一组染色体数,所占比率并未出现随着取样时间的变化而发生明显上升或下降的趋势.在染色体构成上,诱导后代都分别继承了双亲的染色体,除正常杂交产生的异源二倍体外均为非对称性继承.GISH鉴定结果表明本实验所诱导的四倍体为真正的异源四倍体,同时也说明两套异源染色体具有较强的亲和性.在诱导后代中还出现了较小比例的染色体不完全继承个体.对产生这些现象的可能原因进行了探讨.     

胶原模拟多肽对L929细胞粘附的影响

设计合成了3种模拟胶原三螺旋结构或/和整合素识别位点的胶原模拟多肽(CMP),对其进行体外细胞相容性评价,研究其对小鼠成纤维细胞(L929)生长、粘附的影响。实验证实,3种CMP对成纤维细胞生长无明显的细胞毒性反应;3种包被胶原模拟多肽的基底均能在一定程度上促进细胞粘附、生长,具有良好的细胞粘附率和细胞附着形态,其中包含三螺旋结构和整合素识别位点的CMP27具有更好的促粘附效果,细胞粘附数量和形态与胶原接近。初步研究结果证实,胶原三螺旋结构与整合素识别位点共同作用促进L929细胞粘附。因此,CMP可以有效促进细胞粘附,有望作为粘附剂应用于生物医学领域,可为设计以多肽为基础的生物活性材料提供新的研究思路。     

运动与细胞凋亡综述

细胞凋亡是多细胞动物生命活动过程中不可缺少的组成部分,维持着生物细胞生存和死亡间的平衡。无论是低等动物还是高等动物都会如此。哺乳动物的受精、胚胎发生、发育和成熟的过程,构成了组织细胞生死交替,保证了个体发育成熟,是动物存活的需要,也贯穿于动物全部寿命周期。     

紫外线(UV)固化技术在数字成像材料中的应用(一)紫外线(UV)喷墨打印

近年来。数字成像技术不断提高和应用范围的迅速推广，也推动了UV固化技术在这一领域的融合和应用。取得了极大的成效，由于UV固化材料具有快速固化、高效、低污染、节能、优质等特点，很快发展成为一种新型的数字成像材料。目前已实现产业化的主要有UV喷墨打印、印刷电路版数字化制作、计算机直接制版CTP、立体光刻等四种技术，作者拟分为四个专胚予以阐述。本文主要讨论其第一个专题：UV喷墨、打印。     

栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代的细胞遗传学研究

采用基因组荧光原位杂交(GISH)技术,结合改进的染色体滴片和压片法,对栉孔扇贝和虾夷扇贝远缘杂交正、反交子代4-8细胞胚胎及担轮幼虫的染色体构成及其变异进行了研究.结果表明,在染色体数目上,绝大部分正、反交子代早期胚胎的染色体数目为38条,与其双亲一致; 在染色体构成上,绝大部分正、反交子代分别继承了栉孔扇贝和虾夷扇贝各一套染色体,为真正的杂交种,核型也为双亲染色体核型的综合:2n=6m 29(sm,st) 3t;正、反交子代之间在染色体构成上无明显差别,结果说明两种扇贝的属间杂交正反方向均能产生正常的杂交种胚胎,合子中两套染色体具有较强的亲合性.此外,杂交子代在胚胎发育早期还存在较小比例的染色体数目异常、不对称染色体继承等遗传学现象.在群体杂交所产生的正反交子代中还存在极小比例的疑为雌核发育的母本类型个体,但在单对杂交产生的正反交子代中均未见雌核发育的个体.本文就这些异常现象产生的可能原因进行了探讨.     

盐度突降对栉孔扇贝(Chlamys farreri)抗病力指标的影响

通过室内模拟实验研究了海水盐度突降对栉孔扇贝抗病力的影响.设盐度20、25两个处理,以盐度31为对照.将扇贝从盐度31的暂养海水直接转到设计盐度,分别于0h、1h、4h、12h、24h、48h、72h采血分析血细胞数目、血浆蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性.72h注射细菌攻毒,记录存活率.结果表明,盐度突降使血细胞数和SOD活性总体下降,而血浆蛋白含量和ACP活性总体升高.攻毒引起的上述抗病力指标的变化趋势与盐度突降相同,但处理组的响应幅度均低于对照,存活率显著降低.上述结果说明盐度突降损害了栉孔扇贝抵抗感染的能力.     

嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab‘的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,利用^3H掺入法测定嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞的生长具有抑制作用,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20Fab‘可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD20Fab‘通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

金鱼(Carassius auratus)腺垂体激素细胞中的球形病毒及其细胞病理学研究

利用电镜技术，在金鱼腺垂体促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞中发现了一种球形病毒及其发生基质。该病毒在细胞核中形成不规则形态的包涵体，病毒粒子直径为80～100nm，呈中等电子密度，无囊膜。病毒侵染造成了促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞的核膜溶解，染色质变性解体，内质网膨胀以及线粒体内嵴与外膜的溶解。此外，病毒的增殖导致了腺垂体中大量促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞的凋亡。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

低温保存对Hep-G2细胞凋亡的影响

样本质量是体现生物样本库价值的关键,但是低温保存可能导致细胞凋亡及基因表达量的变化,影响样本质量。本文采用流式细胞术与实时荧光定量PCR(qPCR)的方法,研究了Hep-G2细胞在不同条件下冻存后凋亡及相关基因表达量。结果表明:低温保存影响Hep-G2细胞的成活率、凋亡情况及某些凋亡基因表达量。无论冻存过程中是否添加低温保护剂,低温保存都会对细胞的凋亡相关基因表达带来不同程度的影响。不添加保护剂冻存会导致细胞死亡,添加10%DMSO冻存会导致细胞凋亡,复苏培养24 h后细胞的成活率、凋亡情况与相关基因表达量基本与对照组水平一致。     

栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选

使用RepeatMasker软件在栉孔扇贝的6935条ESTs中发现了42条微卫星序列。选取其中的7个序列，根据微卫星位点的旁侧序列设计引物，并对设计出的引物在中国、日本、韩国野生群体中进行多态性检测，发现有6对引物能产生扩增产物，其中有3对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在栉孔扇贝的ESTs序列中存在微卫星位点，从而为扇贝生物中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。     

栉孔扇贝种群的遗传变异分析

采用不连续聚烯酰胺凝胶电泳技术研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个天然种群的六种同工酶。结果表明,两个种群具有基本相同的基因位点控制同工酶的表达,二者都具有居群内的个体差异,中国和日本的两个种群的多态位点比例（P．99）分别为41．18％和45．45％,平均杂合度观测值（Ho)分别为0．1295和0．1531,平均杂合度预期值（He)分别为0．1695和0．2331,各位点平均等位基因数（Ne)分别为1．5294和1．6363。日本栉孔扇贝自然种群的遗传变异明显高于中国栉孔扇贝自然种群。同时各群体中普遍存在杂合子缺失现象。     

栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的FCM法检测

建立了热激、冷激、细菌感染和水质恶化等逆境中栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的流式细胞术检测法。结果发现,该方法可灵敏检出上述条件下,血淋巴细胞中HSP70表达的增加。Duncan检验显示,热激条件下HSP70表达增加最为显著。     

栉孔扇贝不同地理群体的遗传多样性分析

应用AFLP技术对栉孔扇贝的中国长岛群体和韩国东部、西部群体进行了遗传多样性分析。实验表明，中国长岛群体的群体内遗传相似度最高，为0．6754，韩国东部群体次之，为0．6714，韩国西部群体最低，为0．6309；中国长岛群体与韩国东部、西部群体间的遗传距离分别为0．1703和0．1786，韩国两群体间的遗传距离只有0．057。这一结果说明，长岛群体与韩国群体遗传差异较大，韩国两个群体遗传相似度较高，应视为同一个群体。本研究共获得6个韩国两群体的共享特征标记，4个长岛群体的特异性标记，1个韩国西部群体所特有的标记，这些标记可以用于鉴定和区分这三个群体。为提高我国栉孔扇贝群体遗传多样性，以引进韩国西部群体为好。     

栉孔扇贝四倍体幼虫的诱导研究

以栉孔扇贝Chlamys farreri为材料，采用浓度为0．5mg／L的细胞松弛素B(CB)处理、抑制受精卵第一极体排放的方法，进行四倍体诱导研究。5次重复实验结果表明，诱导组和对照组的平均受精率分别为45．0％和56．6％，D形幼虫的平均孵化率分别为5．3％和51．1％。经胚胎和幼虫发育观察发现，在诱导组中异常原肠胚的比例高于对照组；受精后48h，诱导组的滞育担轮幼虫的比例显著高于对照组。在受精后48h采用流式细胞术检测孵化的D形幼虫，诱导组中四倍体幼虫的比例为36％-70％，平均为49％，同时发现了平均比例为31％的三倍体幼虫。本研究表明，该项技术能有效地诱发栉孔扇贝四倍体幼虫，但面临四倍体幼虫孵化率低的问题，今后应设法提高四倍体胚胎和幼虫的发育水平。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒感染的ELISA检测

应用纯化病毒免疫新西兰兔制备的抗血清，进行ELISA分析，检测栉孔扇贝体内急性病毒性坏死症病毒的感染情况。结果表明：一龄贝在整个养殖期间感染该病毒呈现低一高一低的涨落过程，其中7月下旬到8月中旬检出阳性率为75％～95％，为当年感染的高峰时期。对二龄贝感染该病毒的分析结果显示，二龄贝对病毒的感染可能具有一定的抗性。     

急性病毒性坏死症病毒在栉孔扇贝不同器官的感染状况

应用超薄切片、负染电镜技术以及ELISA对自然发病和人工感染发病的栉孔扇贝之外套膜、鳃、肝胰腺、肾、肠、及闭壳肌等主要器官急性病毒性坏死症(Acute Virus Necrobiotic Disease，AVND)病毒的感染状况进行了研究。三种检测方法均表明，病贝的外套膜及肝胰腺为AVND病毒感染最严重的器官，肾以及肠组织次之，鳃及闭壳肌病毒感染程度最轻。本结果同时表明，AVND病毒在病贝体内广泛分布，侵染的细胞主要为上述器官皮下肌细胞的细胞质内，侵染细胞超微结构表现为生物膜肿胀，并出现“髓袢样”结构等病理变化。     

栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨

超薄切片和负染色技术检测栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染状况，结果表明：在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份，病毒检出率分别为80％、100％，此时，病毒感染强度也达到最高；而海湾扇贝整个养殖期间病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，未出现明显的涨落。二种扇贝均检测到类立克次氏体（RLO），但类立克次氏体的感染率和感染强度均未出现明显的涨落，似与扇贝死亡的关系不大。综合分析认为，病毒极可能是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。