凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的构建来自鸡贫血病毒（CAV,chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E．coli BL21（DE3）中表达。用Ni—NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90％,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

人载脂蛋白AV的克隆、表达及初步纯化

通过构建合适的质粒对载脂蛋白AV( ApoAV)进行可溶表达,并通过纯化得到较高纯度的ApoAV蛋白.含有人源ApoAV编码基因的质粒出发,利用载体ppSUMO构建融合表达质粒,转化入表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中,对其表达条件进行优化.然后利用ppSUMO上的His亲和标签对其进行亲和层析纯化.得到了较高纯...     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC—SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC—SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物进行Ni^2＋-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a—EC—SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E．coli BL21（DE3）后,重组蛋白获得表达,Ni^2＋-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85％以上,经噻唑蓝（MTT）法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC—SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC—SOD3．凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

TAT-凋亡蛋白质制备与抗肿瘤活性研究

目的 制备TAT-凋亡蛋白质并研究其抗肿瘤活性.方法 将重组质粒pET-28b-TAT-vp3转/N.E.coli BL21(DE3)中表达其蛋白质,利用Ni-NTA亲和柱纯化目的 蛋白质包涵体,纯化样品透析复性后研究其抗肿瘤活性.结果 30℃时重组蛋白质包涵体表达量最高,尿素变性条件下用Ni-NTA亲和柱层析纯化包涵体,用500 mmol/L咪唑溶液洗脱,从镍柱上解离的目标蛋白质纯度达到92%以上.MTT实验表明,纯化后蛋白质浓度10μg/mL时,HeLa细胞存活率降至42%(ICso=4.2μg/mL);动物实验表明,样品组抑瘤率可达到48.3%.结论 大肠杆菌表达的TAT-凋亡蛋白质具有抗肿瘤效应.     

TAT-凋亡蛋白质制备与抗肿瘤活性研究

目的制备TAT-凋亡蛋白质并研究其抗肿瘤活性。方法将重组质粒pET-28b-TAT-vp3转入E.coliBL21(DE3)中表达其蛋白质,利用Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白质包涵体,纯化样品透析复性后研究其抗肿瘤活性。结果30℃时重组蛋白质包涵体表达量最高,尿素变性条件下用Ni-NTA亲和柱层析纯化包涵体,用500mmol/L咪唑溶液洗脱,从镍柱上解离的目标蛋白质纯度达到92%以上。MTT实验表明,纯化后蛋白质浓度10μg/mL时,HeLa细胞存活率降至42%(IC50=4.2μg/mL);动物实验表明,样品组抑瘤率可达到48.3%。结论大肠杆菌表达的TAT-凋亡蛋白质具有抗肿瘤效应。     

Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化

为高效制备可溶性人源Nanog蛋白,降低Nanog蛋白的使用成本。该研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌(pET32a-Nanog),利用IPTG诱导进行可溶性融合表达。采用镍离子柱亲和层析法纯化产物并将纯化后产物进行肠激酶酶切后得到目的蛋白,Western blot鉴定该蛋白抗体结合的特异性并进一步优化发酵条件。结果表明,原核表达载体pET32a-Nanog构建成功,可在大肠杆菌中与硫氧还蛋白融合表达,融合蛋白经肠激酶酶切后得到相对分子质量约为38 kDa的蛋白,Western blot鉴定该蛋白可与Nanog抗体特异性结合。在摇瓶培养条件下,得到最优发酵条件是诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、甘油为补料碳源;15 L发酵罐上进一步优化溶氧条件及温度控制方式,最终在溶氧设置在30%条件下,37℃(诱导期间30℃维持30 min)发酵12 h后得到最高Nanog产量1 386.4 mg/L,经蛋白纯化后纯度达到90%,为后续Nanog多克隆抗体的制备和基础医学实验研究奠定了基础。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

凋亡素融合蛋白质高表达菌株的筛选及其产物活性测定

目的筛选凋亡素-HBD融合蛋白质高表达的工程菌株,验证其目标产物具有抑制肿瘤细胞增值的活性。方法在不同大肠杆菌宿主中凋亡素融合蛋白质表达,筛选出高表达工程菌,随后诱导表达和纯化凋亡素融合蛋白质,并通过噻唑蓝法（MTT法）检测目标产物对肿瘤细胞的抑制活性。结果凋亡素-HBD融合蛋白质在SG工程菌的表达量较好。MTT法检测表明,凋亡素融合蛋白质有抑制HeLa细胞增值的活性。结论获得一种凋亡素-HBD融合蛋白质的高表达工程菌株,并证实其产物能够进入HeLa细胞并诱导细胞凋亡。