含IL-2基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫效果

目的构建含白细胞介素-2(IL-2)基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗,并考察免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site,IRES)基因克隆到质粒pVAX1载体多克隆位点处,再将乙肝病毒表面抗原(HB-sAg)基因和IL-2基因分别连接在IRES基因的两侧,构建出乙肝病毒DNA疫苗pHII。将pHII转染COS-7细胞,进行瞬时表达。大量提取质粒后,按0、2、4周程序免疫BALB/c小鼠,以pVAX1质粒为阴性对照,pVAX/HBsAg质粒为阳性对照。第1针免疫1周后开始眼眶采血,检测血清中HBsAg和HBsAb含量。第1针免疫13周后处死小鼠,用流式细胞仪检测其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子数量。结果在转染pHII质粒的COS-7细胞上清液中检测到HBsAg和IL-2的表达。实验组和阳性对照组小鼠分别于第1针免疫2、4周后,在血清中检测出HBsAb,但阴性对照组未测出。以上3组均未检测出HBsAg。实验组与阳性对照组相比,产生抗体的时间提前2周,抗体阳转率提高2.5倍,产生抗体的量也提高了近3倍。实验组CD4+分子数量和CD4+/CD8+值均高于阳性对照组。结论乙肝病毒DNA疫苗pHII成功诱导出小鼠的免疫应答,其免疫效果明显优于不含分子佐剂的乙肝DNA疫苗。     

口服CD226 DNA疫苗对小鼠免疫功能的影响

目的制备口服CD226 DNA疫苗,观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法以质粒CD226-PCR2.1-ToPo为模板,PCR扩增CD226基因,克隆至pcDNA3.1载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD226,利用脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染CT-26细胞株,采用RT-PCR法、Western blot法、流式细胞术检测CD226基因在CT-26细胞中的表达。将质粒pcDNA3.1-CD226用脂质体Lipofectamine TM2000包裹制成CD226 DNA疫苗(100μg质粒/100μl脂质体),经灌胃免疫C57BL/6小鼠,实验分CD226疫苗组、pcDNA3.1组和生理盐水组,流式细胞术检测CD226在小鼠脾细胞中的表达;还原酶法检测NO分泌水平;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、IFNγ和TNF-α)分泌水平;Real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平。结果质粒pcDNA3.1-CD226经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒pcDNA3.1-CD226转染CT-26细胞的转染率为32.14%,转染的CT-26细胞检测到CD226蛋白表达。CD226疫苗组CD226 CD4+T细胞的绝对数、NK细胞杀伤活性、NO分泌水平、脾细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-2分泌水平、肠黏膜组织内TNF-α和IFNγ基因mRNA水平均明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P0.05);而CD226疫苗组脾细胞培养上清中IL-4分泌水平及肠黏膜组织内IL-2和IL-4基因mRNA水平,与pcDNA3.1组和生理盐水组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD226DNA疫苗经灌胃免疫,可诱导小鼠全身Th1型免疫应答增强和肠道局部部分Th1型免疫应答增强。     

乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗在动物中的免疫应答

目的评价乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗的免疫应答。方法用联合疫苗及其单价疫苗分别免疫豚鼠和BALB/c小鼠,检测两种疫苗的免疫应答。结果联合疫苗与卡介苗豚鼠皮肤PPD反应直径数值相近(P>0·05),联合疫苗与乙肝疫苗免疫小鼠血清乙肝抗体滴度差异无显著意义(P>0·05);联合疫苗免疫小鼠淋巴细胞转化刺激指数、IL-2含量均高于单价疫苗,差异有显著意义(P<0·001)。结论乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗能有效地诱导实验动物的体液免疫和细胞免疫。     

汉坦病毒DNA疫苗pVAX/G2诱导小鼠的免疫应答

目的探讨含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答。方法重组质粒pVAX/G2转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法(IFA)检测瞬时表达产物。经碱裂解法提取质粒pVAX/G2,Sepharose CL-4B柱层析纯化后,免疫BALB/c小鼠(SPF),并采用含有人IL-2基因的重组质粒pVAX/IL-2及重组人IL-2蛋白作为DNA疫苗的佐剂,检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。结果重组质粒pVAX/G2能够在真核细胞中表达。免疫小鼠血清中能够检测到抗汉坦病毒中和抗体、酶标抗体和荧光抗体。淋转刺激指数和脾淋巴细胞上清液中IL-2活性,与空载体pVAX1阴性对照比较差异有显著意义。质粒佐剂pVAX/IL-2能显著提高DNA疫苗的细胞免疫水平。结论含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定强度的体液免疫和细胞免疫应答。     

插入ISS的HBV DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的 探讨提高DNA疫苗免疫原性的有效途径。方法 采用定向克隆和重组DNA技术分别构建在不同位置、含不同CpG数目的ISS的重组质粒载体pcDNA3.1+-S/CpG1、pcDNA3.1+-S/CpG2和pcDNA3.1+-S/CpG1+CpG2,通过肌肉注射免疫 C57BL/6小鼠,比较其细胞和体液免疫应答。结果 通过PCR及测序证实已正确完整地插入ISS,成功构建了含ISS的重组质粒载体,pcDNA3.1+-S/CpC各组与pcDNA3.1+-S组的比较,细胞和体液免疫应答有增强的倾向。结论 通过观察插入ISS对DNA疫苗免疫原性的影响,为进一步研究奠定基础。     

表皮生长因子受体-3真核表达质粒的构建及其免疫小鼠抗体滴度的检测

目的构建表皮生长因子受体-3(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3,ErbB3)真核表达质粒,并检测其免疫小鼠血清抗体滴度。方法以乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增ErbB3全长基因,插入pcDNA3.1-myc/His载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3。同时以质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3为模板,PCR扩增ErbB3-ECD和ErbB3-RLD基因,插入pET-28a(+)和pGEX-KG载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD;将质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定后,经GST柱或镍亲和柱纯化,BCA法定量纯化后蛋白。以60μg质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,经小鼠尾静脉采血,分离血清,以纯化后的ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白为包被抗原,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度。结果 3种质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白ErbB3-ECD和ErbB3-RLD在相对分子质量约76 000和46 000处可见特异蛋白条带,浓度分别为2和1 mg/ml,免疫后的小鼠血清抗体滴度分别为1︰400和1︰10 000。结论 ErbB3全长质粒免疫BALB/c小鼠后,经ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白初步筛选,已获得ErbB3的多克隆抗体,为后期ErbB3单抗的制备以及以ErbB3为靶点的核酸免疫治疗奠定了基础。     

重组HBcAg与HBsAg混合抗原的免疫效果

目的观察重组HBcAg与HBsAg混合抗原免疫BALB/c小鼠后体液免疫与细胞免疫的效果。方法配制含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的混合抗原,分别免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法测定抗体滴度和细胞因子水平;采用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果HBcAg与HBsAg混合抗原免疫小鼠产生的IFN-γ量明显高于二者单独免疫,CD3+和CD4+水平显著增高;含Al(OH)3佐剂的混合抗原CD8+水平明显高于阴性对照组;混合抗原免疫小鼠血清产生的抗-HBs抗体与2倍剂量的HBsAg单独免疫相比,差异无显著意义。含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的疫苗免疫效果差异无显著意义。结论重组HBcAg与HBsAg混合抗原表现出良好的体液免疫与细胞免疫效果,为治疗性乙肝疫苗的开发提供了依据。     

人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性

目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。     

重组质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的构建及其表达

目的构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70,并筛选稳定表达Her2蛋白的细胞株。方法采用RT-PCR法扩增人乳腺癌SKBR-3细胞中Her2和hsp70基因,插入质粒pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70,经双酶切后,回收hsp70基因,连接入质粒pcDNA3.1-Her2的N-末端,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70。将质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-Her2-hsp70分别转染小鼠乳腺癌4T-1细胞,采用Western blot法检测Her2蛋白的表达。结果重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70经双酶切鉴定,证明构建;转染质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的4T-1细胞中可见相对分子质量约65 000的Her2蛋白的表达。结论已成功构建了重组质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70,并获得了稳定表达Her2蛋白的小鼠乳腺癌4T-1细胞,为进一步探讨佐剂辅助异种抗原产生的抗肿瘤免疫效应奠定了基础。     

ISCOMS重组乙型肝炎疫苗的研究

目的　提高CHO细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的免疫原性。方法　采用透析法制备HBsAg免疫刺激复合物 (immunostimulatingcomplexes简称ISCOMS)。用放免法 (RIA)检测免疫小鼠的抗体滴度 ;标记胸腺嘧啶掺入法 (3H TdR)检测小鼠脾淋巴细胞转化率 ;CTLL 细胞株 XTT法检测IL 2活性。结果　经电镜观察ISCOMS颗粒呈蜂窝状 ,直径为 30～ 4 0nm左右。SDS PAGE分析 ,制备的ISCOMS颗粒HBsAg蛋白均由P2 3、GP2 7和GP30组成。用Bradfords法测定ISCOMS蛋白回收率为 4 1 5 0 %。免疫NIH小鼠结果显示ISCOMS重组乙肝疫苗和铝佐剂疫苗的ED50 分别为 10 3 2 2 5 5和 2 5 80 6 4 ;ISCOMS组的相对效力是铝佐剂组的 4倍。刺激指数 (SI)分别为 6 78± 2 32和 3 12± 0 5 4。IL 2水平分别是 10 2IU ml± 2 12IU ml和 4 95IU ml± 0 86IU ml。结论　ISCOMS重组乙型肝炎疫苗稳定性好 ,免疫原性强 ,抗体产生早 ,滴度高 ,并且能激起细胞免疫 ,有可能发展成为新一代疫苗。     

CpG-ODN对乙肝核酸疫苗及重组疫苗免疫效果的影响

目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)对乙肝核酸疫苗及重组(CHO细胞)疫苗免疫效果的影响。方法核酸疫苗实验组用CpGODN与乙肝核酸疫苗联合免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射核酸疫苗,阴性对照组注射质粒pVAX1;重组疫苗分4个实验组,用CpGODN与不同剂量的重组疫苗配伍后分别免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射重组疫苗,阴性对照组注射生理盐水。应用ELISA检测小鼠血清中的抗HBs水平。结果CpG与乙肝核酸疫苗组抗体阳转率比阳性对照组提高3倍,抗体水平提高2倍。CpG与重组疫苗组的阳转率和阳转时间均高于或早于CpG与核酸疫苗实验组。加入CpGODN后,即使重组疫苗用量减少3倍,诱导抗体水平和阳转率均无明显改变。结论CpGODN可提高乙肝核酸疫苗和重组疫苗的免疫效果,并使抗体产生的时间提前。     

重组乙型肝炎病毒核心抗原的免疫原性及其对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫增强作用

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴性对照组(NS)、HBcAg组(C)、HBsAg组(S)、HBsAg+铝佐剂组(S+Al)、HBsAg+HBcAg混合组(S+C)及HBsAg+HBcAg+铝佐剂组(S+C+Al),用相应抗原免疫各组小鼠,分别于第0天、第14天经小鼠双侧大腿肌肉进行初次和加强免疫1次,间接ELISA法检测各组小鼠血清中HBsAg和HBcAg的特异性抗体水平,分析HBsAg特异性抗体亚类,ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞中HBsAg特异性IFNγ、HBcAg特异性IFNγ及HBsAg特异性IL-4水平。结果电镜观察可见HBsAg和HBcAg均呈大小均一的VLP结构,二者混合后有聚集现象。初次免疫后,S+C组的HBsAg特异性抗体水平与S组差异无统计学意义(P=0.074),加强免疫后,S+C组HBsAg特异性抗体水平明显高于S组(P=0.002),C组和S+C组均可产生高水平HBcAg特异性抗体。S组HBsAg抗体亚类以IgG1为主,S+C组以IgG2a为主。S+C组HBsAg特异性IFNγ斑点数明显高于S组、S+Al组和S+C+Al组(P<0.05),C组与S+C组HBcAg特异性IFNγ斑点数均较高,与S+C+Al组比较,S+Al组HBsAg特异性IL-4斑点数明显升高(P=0.026)。结论 HBcAg具有良好的免疫原性,可增强HBsAg的免疫反应,使反应向Th1方向极化,为治疗性乙肝疫苗的研发奠定了基础。     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用

目的研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用。方法以BCG-CpG-DNA与重组HBsAg混合免疫小鼠,以铝佐剂疫苗为对照,采用放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平,ELISA法分析抗体亚类,酶联免疫斑点试验(ELIS-POT)检测CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能。结果BCG-CpG-DNA能提高抗-HBs中和抗体水平,促进抗原特异性IgG2a的产生,诱导Th1型免疫应答,与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2反应。同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用,实验组与对照组比较差异有显著意义。结论BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,有可能成为一种新型的免疫佐剂。     

壳聚糖纳米粒在乙型肝炎疫苗中的应用

目的比较包裹乙型肝炎(简称乙肝)的壳聚糖纳米粒与常规铝佐剂乙肝疫苗的免疫效果差异,并对壳聚糖佐剂的应用效果进行评价。方法采用离子交联法制备20、30及40μg/ml的包裹乙肝疫苗的壳聚糖纳米粒溶液,激光粒度分析仪测定纳米粒粒径和多分散系数,BCA法测定包封率;将BALB/c小鼠随机分为4组:铝佐剂对照组、空白纳米粒对照组、常规疫苗组和壳聚糖疫苗组,肌肉注射免疫小鼠,2μg/只,隔周免疫1次,共2次。采用全自动免疫发光分析仪对小鼠血清中乙肝表面抗体进行定量分析。结果制备的载乙肝疫苗壳聚糖纳米颗粒粒径为(262.7±10.8)nm,与空白壳聚糖纳米粒粒径相比,略有减小,多分散系数为(0.228±0.016);随着抗原浓度升高、4℃放置3个月及反复冻融,纳米粒的包封率均未发生显著变化,可达80%左右;壳聚糖疫苗组在小鼠体内产生的表面抗体滴度最高可达1∶80 000以上,并从第8周起,与常规疫苗组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论壳聚糖纳米粒作为新型疫苗佐剂,具有一定的应用价值和进一步研究的意义。     

HBsAg与GM-CSF基因双表达载体的构建及其免疫效果

目的构建乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg)与GM-CSF基因的双表达载体,提高乙肝病毒DNA疫苗的免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将HBsAg基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点处,构建双表达载体pHIG。将pHIG转染到COS-7细胞中,检测瞬时表达情况,并用双表达质粒pHIG免疫BALB/c小鼠,检测免疫后小鼠血清中抗-HBs及其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子的数量。结果在转染pHIG质粒的COS-7细胞上清液中有HBsAg的表达,pHIG双表达质粒组比pVAX/HBs组抗体产生时间提前2周,抗体阳转率提高2倍,小鼠脾脏T细胞表面CD4+分子数量及CD4+/CD8+值均高于pVAX/HBs组。结论HBsAg与GM-CSF基因双表达质粒能引起小鼠特异性免疫应答,并可提高免疫效果。     

CpG ODN2006对乙型肝炎疫苗免疫BALB/c小鼠抗体产生的影响

目的探讨合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpGODN2006)对乙型肝炎疫苗增强小鼠特异性抗体产生的效应。方法采用BALB/c小鼠,经后腿胫骨前肌注免疫2次,ELISA法检测血清中抗HBsIgG效价。结果疫苗+CpG组较疫苗组和空白对照组的抗HBsIgG效价明显增高,且维持时间长。结论CpGODN2006对小鼠抗HBsIgG的产生具有明显的增强作用。