鲫鱼卵唾液酸糖蛋白化学结构分析及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的：成熟的鲫鱼卵经提取、分离纯化得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs,CA-SGP）,分析其化学结构,及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。方法：采用水提法从成熟鲫鱼卵中提取水溶性蛋白,经阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化鲫鱼卵水溶性蛋白得到CA-SGP,测定其基本组成,采用高效凝胶液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子质量和纯度,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定其单糖组成;采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ,COLⅠ）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的分泌量及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性,茜素红染色法测定矿化结节的数量。结果：得到单一的组分CA-SGP,在高效凝胶过滤色谱色谱图上呈现单一的糖和蛋白的检测重叠峰,在凝胶电泳图上呈现单一弥散性条带,其蛋白质含量为14.33%,己糖含量为62.81%,N-乙酰神经氨酸（N-acetylneurainic acid,Neu5Ac）含量为19.72%。单糖组成测定结果显示：CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺组成,其物质的量比为7.61∶6.70∶1.00;MC3T3-E1细胞与CA-SGP共同孵育后,其增殖率显著增加,COLⅠ和OCN的分泌量分别增加了39.28%和83.06%,ALP活性提高了285.08%,矿化结节的数量增加了96.41%,说明CA-SGP显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。结论：CA-SGP为富含Neu5Ac的糖蛋白,具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用,对开发抗骨质疏松功能性食品具有重要意义。     

虾肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的:从红虾副产物中提取虾肽,研究其促MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的活性。方法:用MTT法检测不同浓度虾肽对MC3T3-E1成骨细胞存活率的影响;诱导成骨细胞分化,在3 d和7 d时,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性,在7 d和14 d时,测定其细胞骨钙素(OCN)及Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)含量,21 d时茜素红染色测定细胞诱导培养矿化程度;采用qPCR和Western blot方法检测虾肽对OPG/RANKL/RANK信号通路中骨形成关键基因和蛋白OPG、RANKL以及RUNX2表达的影响。结果:虾肽质量浓度为0.02,0.05,0.1 mg/mL时,显著促进MC3T3-E1细胞的增殖;ALP、OCN及COL-Ⅰ的含量相较于对照组均增加,矿化结节面积显著增大(P <0.05);此外,虾肽上调了ALP、OCN、COL-Ⅰ基因的表达,促进OPG和RUNX2基因及蛋白表达的水平,抑制RANKL基因及蛋白表达的水平。结论:虾肽能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化与矿化,激活OPG/RANKL/RANK信号通路,从而促进成骨细胞的分化及骨形成。     

罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的:研究罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物(tilapia fish scale collagen hydrolysate,FH)对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的增殖和分化的影响。方法:采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,用p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)法测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,Elisa酶联免疫法检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的分泌量,茜素红染色法测定细胞外基质矿化结节的数量。结果:与空白对照组相比,FH对细胞的增殖性没有显著的促进作用,但是可以显著提高细胞ALP活性,促进Col Ⅰ和OCN的分泌。此外,FH可以促进细胞矿化结节的生成。结论:FH通过促进成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化来提高骨的形成,对开发抗骨质疏松症和骨关节炎等疾病的功能性食品有重要的意义。     

巴戟天多糖的理化性质及其对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响

以巴戟天为原料,通过酶辅助浸提法提取多糖,采用化学和仪器分析法研究多糖的pH、相对黏度、溶解性、光谱特征、空间构像等理化性质,采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,评价多糖提取物对成骨细胞增殖的影响。结果表明,巴戟天多糖属于酸性多糖,pH为6.15±0.13,相对黏度为1.26±0.12,具有糖的特性和三股螺旋结构,溶解性较好,不含蛋白质或多肽;巴戟天多糖提取物浓度为50 μg/mL时,MC3T3-E1细胞增殖率极显著增加(P<0.01),达149.67%,COLⅠ和OCN的分泌量极显著增加(P<0.01),分别增加44.98%和85.01%,ALP活性极显著提高(P<0.01),提高了258.95%。表明巴戟天多糖提取物能显著促进MC3T3-E1细胞增殖与分化。     

鱿鱼皮胶原蛋白水解肽对镉抑制MC3T3-E1增殖、分化及钙化的影响

目的:探究秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白水解肽增强MC3T3-E1细胞抗骨质疏松的作用。方法:将培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组、氯化镉损伤组和胶原蛋白水解肽干预组;利用MTT法确定氯化镉的半数抑制浓度,建立细胞损伤模型;根据各组细胞增殖率差异,确定最佳胶原蛋白水解肽的添加量;通过细胞周期、凋亡,碱性磷酸酶活性的测定及Alizarin red染色法分析胶原蛋白水解肽在细胞增殖、分化、钙化阶段拮抗氯化镉的抑制作用。结果:与氯化镉损伤组相比,胶原蛋白水解肽干预组细胞活性升高(P0.01);处于G1期的细胞数量减小(P0.05),S期细胞数量增大(P0.05);凋亡率降低(P0.05);9,12,15 d时AKP活性升高(P0.05,P0.01,P0.01)。结论 :摄入一定剂量的氯化镉会抑制MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和钙化。胶原蛋白水解肽在一定程度上可改善此类损伤对MC3T3-E1细胞的影响。     

鸡蛋黄蛋白质水解产物制备及其对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

鸡蛋黄经脱脂得到蛋黄蛋白质,直接以MC3T3-E1细胞增殖活力为指标,对水解条件进行优化,从而制备蛋黄蛋白质水解产物(egg yolk proteins hydrolysate,EYPH)并对其促MC3T3-E1细胞增殖分化的活性进行研究。结果表明:在对比胰蛋白酶与风味蛋白酶水解过程中,发现单一胰蛋白酶反应得到产物活性最好,胰蛋白酶反应的最佳水解条件为水解时间6 h、水解温度37℃、酶与底物质量比1∶50、p H 8.0。EYPH使MC3T3-E1细胞增殖活力得到提高,为129.89%,细胞周期分析得到S期细胞增加了4.69%,这2个方面证实EYPH对MC3T3-E1细胞的增殖活力有显著的提高。EYPH对MC3T3-E1细胞分化矿化有显著影响,碱性磷酸酶活力提高了9.1%;刺激骨钙素分泌,其含量上升2 mg/mL;形成更多的矿化结节。此外,EYPH还能刺激RUNX2特异性转录因子的基因表达,表达量提高了6.12倍。结果说明EYPH对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化有显著的促进作用,因此,EYPH对于抗骨质疏松方面有较好的应用潜力,为开发其功能性食品提供一定的数据参考。     

卵黄高磷蛋白对壳聚糖膜基质上MC3T3-E1细胞增殖的影响

本研究制备了壳聚糖和氧化石墨烯/壳聚糖复合膜,并采用CCK-8法、Annexin V/PI双染法和PI染色检测了蛋黄中提取的卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞在该复合膜基质上的生理活动的影响。结果表明:壳聚糖膜对细胞无毒性影响,并通过提高S期细胞所占比例,使MC3T3-E1细胞活性提高了31.92%,抑制细胞凋亡,使凋亡率下降45.78%;氧化石墨烯/壳聚糖膜会提高细胞的凋亡率,氧化石墨烯含量越高,促进凋亡越明显,凋亡率在氧化石墨烯含量为2%时最高,为17.64%;在壳聚糖膜基质上,100 μg/mL卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞促进增殖作用最显著(p<0.05),细胞活性提高81.59%,同时降低了细胞的凋亡比例;蛋白浓度为500 μg/mL时,细胞活性下降4.47%,促进了细胞凋亡。综上所述,壳聚糖和低浓度卵黄高磷蛋白均能提高MC3T3-E1细胞的活性。     

金枪鱼鱼骨活性钙对鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力和凋亡作用

目的:以金枪鱼骨为原料,制备柠檬酸-苹果酸钙剂(CMC),研究其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞活力、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)培养液中,分别加入高浓度(1 μg/mL)CMC和低浓度(0.1 μg/mL)CMC,利用MTT法检测对MC3T3-E1细胞活力的影响,流式细胞仪检测血清饥饿诱导的细胞凋亡。结果:高浓度和低浓度的钙对MC3T3-E1细胞活力均有显著的促进作用,24 h的高钙组的细胞增长率(9.67%)优于低钙组(8.95%);36 h和48 h后低钙组的增长率分别为14.96%和20.33%,明显优于36 h和48 h作用后的高钙组(6.23%和1.73%),两组细胞凋亡率与空白组比较差异较小,且均显著低于对照组(p<0.01)。结论:CMC高钙组和CMC低钙组在一定浓度范围内,能促进MC3T3-E1细胞活力显著增强,并且改善血清饥饿诱导的成骨前体细胞凋亡。     

儿童配方奶粉对Caco-2细胞钙转运及对成骨细胞增殖、矿化的影响

为评价某市售儿童成长配方奶粉的补钙和促进骨骼生长能力,以常见市售纯牛奶A作为对照,运用人结肠腺癌细胞（Caco-2）单层模型,研究其对钙离子转运的作用;运用成骨细胞（MC3T3-E1）矿化模型,研究其对成骨细胞增殖与矿化的影响。Caco-2细胞模型结果表明,各剂量组儿童配方奶粉组的钙转运量均高于市售纯牛奶A,但相较空白组无显著性差异（p<0.05）。成骨细胞增殖实验结果表明,5~50 μg/mL的儿童配方奶粉对成骨细胞均有促进增殖作用,增殖速度均在30%以上;并测定细胞碱性磷酸酶活性,当儿童配方奶粉质量浓度为50 μg/mL时,酶活达7.79 U/g蛋白,相较空白组极显著提高（p<0.01）,较市售纯牛奶A的效果更稳定。成骨细胞矿化结果表明,5~50 μg/mL儿童配方奶粉能显著促进成骨细胞产生矿化结晶,50 μg/mL时茜素红吸光值均为0.180,对比空白组提高50%以上,较市售纯牛奶A矿化程度更稳定。综上实验结果,儿童配方奶粉虽对钙在小肠上皮的转运吸收无明显促进作用,但很可能通过促进骨生长而对儿童生长发育起作用。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白毒理学评价及对其蓄积靶器官的研究

目的:探究鲫鱼卵唾液酸糖蛋白的食用安全性及其在体内的蓄积靶器官。方法:采用急性毒性试验,Ames试验、骨髓微核试验、小鼠精子畸形试验等3项遗传毒性试验和大鼠90 d喂养试验对鲫鱼卵唾液酸糖蛋白进行毒理学评价;以体内唾液酸含量变化为追踪目标,ICR小鼠被连续灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白10 d后,按试剂盒法检测其脾、心、肾、肝、肌肉、脑、睾丸、卵巢及骨中唾液酸含量。结果:小鼠经口最大耐受剂量大于45 g/(kg bw),鲫鱼卵唾液酸糖蛋白属无毒级别,3项遗传毒性试验结果均为阴性,90 d喂养试验未见大鼠脏体比、血常规、血清及尿液生化指标出现明显异常;经鲫鱼卵唾液酸糖蛋白干预后,小鼠股骨、胫骨及腰椎中唾液酸含量显著上升(P0.01),其它器官唾液酸含量无显著变化。结论:鲫鱼卵唾液酸糖蛋白无急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性,骨组织为其蓄积靶器官。     

响应面法优化龟甲蛋白提取工艺及其对MC3T3-E1细胞增殖活性

目的：优化龟甲蛋白提取工艺,筛选龟甲促成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性组分。方法：以蛋白含量及对MC3T3-E1细胞增殖率为指标筛选龟甲蛋白提取方法;以料液比、提取温度、时间为自变量,龟甲蛋白含量为因变量,进行单因素提取研究,结合响应面试验设计,获得提取龟甲蛋白最佳工艺;通过超滤技术将龟甲蛋白按分子量分为5个不同组分：总提组分（组分1）,Mw>10 kDa组分（组分2）,Mw：3~10 kDa组分（组分3）,Mw：1~3 kDa组分（组分4）,Mw<1 kDa组分（组分5）,CCK8法测定不同浓度龟甲蛋白（12.5、25、50、100、200 μg/mL）及其不同组分对MC3T3-E1细胞增殖率的影响。结果：磁力搅拌方法得到的龟甲蛋白含量最高,且活性最佳,龟甲蛋白最佳提取条件为料液比1：13（g/mL）、提取温度30℃、提取3 h,此条件下测得龟甲蛋白含量为15.16%;龟甲蛋白不同组分均能促进MC3T3-E1前成骨样细胞增殖,并呈浓度依赖性,在浓度为200 μg/mL时,组分1~5对细胞的增殖率分别为20.58%、25.30%、30.24%、37.89%、38.15%,分子量小于1 kDa的组分促MC3T3-E1细胞增殖活性最佳。结论：本研究为龟甲蛋白的制备工艺提供参考,并证明龟甲蛋白及其不同组分均具有较好的促成骨细胞增殖活性,其中分子量小于1 kDa组分对MC3T3-E1细胞增殖的效果最佳。     

牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

目的：为制备人体高效吸收利用的补钙剂并探究其对MC3T3-E1细胞成骨活性的影响。方法：对牛骨多肽进行钙螯合处理,以钙螯合能力为考察指标,通过响应面方法确定最佳制备条件;利用红外光谱、X射线衍射和原子吸收等方法探究肽钙螯合物的结构特性及其稳定性;通过细胞实验探究牛骨肽钙螯合物对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的影响。结果：制备牛骨肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2.97∶1、温度62.54℃、pH 9.06。在该条件下,钙螯合能力达到55.65 μg/mg。光谱结构分析结果表明氨基氮、羟基氧和羧基氧是钙主要螯合位点,二者之间主要通过配位键结合,且肽螯合钙后分子质量增加;此外,牛骨肽钙螯合物稳定性受温度影响较小,但对pH值较敏感。MC3T3-E1细胞实验结果表明肽钙螯合物具有明显促MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用。结论：制备的牛骨肽钙螯合物具有潜在的促MC3T3-E1细胞成骨活性功效。     

鱿鱼皮胶原蛋白对H_2O_2诱导MC3T3-E1损伤的修复作用

目的:探究秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白增强MC3T3-E1细胞抗自由基损伤的作用机制。方法:将培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组、H2O2损伤组和胶原蛋白干预组;利用MTT法确定H2O2的半数抑制浓度,建立自由基损伤的细胞模型,通过试剂盒测定SOD活性和MDA含量来确定最佳的胶原蛋白添加量;在倒置显微镜下观察各分组的细胞形态;用流氏细胞仪检测细胞凋亡率,并分析细胞增殖周期;实时荧光定量RT-PCR测定HSP70和Bax的表达水平。结果 :与H2O2损伤组相比,胶原蛋白干预组SOD活性升高(P0.05),MDA含量降低(P0.05),凋亡率降低(P0.05),G0-G1期细胞百分率减小(P0.05),S期细胞百分率增大(P0.05),Bax表达减弱,HSP70表达增强(P0.05)。结论:摄入一定剂量的H2O2会导致MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤并促进其凋亡,而胶原蛋白可以改善此类损伤对MC3T3-E1细胞的影响。     

盐麸子对细胞氧化损伤及3T3-L1细胞分化的影响

本研究利用体外细胞模型,在细胞层面上,探讨了盐麸子不同溶剂酚类物质提取物对细胞氧化损伤的保护作用,以及对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制活性。结果表明,盐麸子3种溶剂提取物及游离态多酚对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤具有良好的保护作用,可显著降低细胞内的活性氧含量,减少细胞凋亡;同时可以显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。该研究结果为盐麸子的进一步应用和开发提供了一定的科学依据。     

荷叶生物碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响

目的:研究荷叶生物碱提取物对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其可能的作用机理。方法:采用MTT法检测荷叶生物碱提取物(LLAE)对前脂肪细胞生长的抑制效果并确定半抑制浓度(IC50);流式细胞仪技术测定细胞周期及凋亡情况;使用诱导剂对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色法分析荷叶生物碱提取物(LLAE)对前脂肪细胞分化程度的影响。结果:荷叶生物碱提取物(LLAE)能显著地抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖且呈剂量时间依赖性;在G0/G1期产生阻滞,有效诱导细胞凋亡;能显著地抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,降低细胞中脂肪滴的积累。结论:荷叶生物碱提取物(LLAE)能有效地抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖及分化,揭示其可能具有预防肥胖的功效。     

多不饱和脂肪酸对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

本文利用MTS比色分析法、细胞形态学分析法及诱导分化法结合油红染色比色分析法研究了α-亚麻酸(alpha-linolenic acid,ALA)、亚油酸(linoleic acid,LA)对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。MTS结果显示,在一定浓度范围内ALA、LA均能呈剂量依赖关系和时间依赖关系的抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,且ALA抑制增殖作用强于LA;细胞形态学分析结果显示,ALA、LA在高浓度时均显示出细胞毒性作用;倒置显微镜观察和油红染色检测结果显示,ALA、LA、ALA/LA混合脂肪酸(1:1,n/n)在12.5~200μmol/L浓度范围内均能浓度依赖式的抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,且ALA抑制分化作用强于LA,但当浓度100μmol/L时,ALA/LA混合脂肪酸(1:1,n/n)的抑制分化作用强于同浓度的ALA,当浓度为200μmol/L时,比较ALA/LA摩尔比为1:4、1:2、1:1的混合脂肪酸抑制分化效果发现,比值为1:1的略强但相互之间效果差异不明显。     

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞株MG-63细胞中OPG/RANKL表达的影响

目的研究二膦酸盐作用于人骨肉瘤细胞株MG-63细胞后,对细胞中成骨细胞护骨素(OPG)及细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达的影响。方法人骨肉瘤细胞株MG-63细胞培养、传代后分为:二膦酸盐10μmol/L组、二膦酸盐50μmol/L组和阴性对照组3组,保温72 h后,应用RT-PCR和Western blot检测干预后OPG和RANKL mRNA和蛋白水平的表达。结果二膦酸盐作用于人骨肉瘤细胞株MG-63细胞后,细胞中OPG mRNA和蛋白水平表达升高,RANKL mRNA及蛋白水平则降低(均P<0.05)。结论二膦酸盐可能通过调节人骨肉瘤细胞株MG-63细胞OPG/RANKL轴的表达,抑制骨肉瘤的溶骨性破坏,对治疗人骨肉瘤有潜在价值。     

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞株MG-63细胞中OPG/RANKL表达的影响

目的 研究二膦酸盐作用于人骨肉瘤细胞株MG-63细胞后,对细胞中成骨细胞护骨素(OPG)及细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达的影响.方法 人骨肉瘤细胞株MG-63细胞培养、传代后分为:二膦酸盐10 μmol/L组、二膦酸盐50 μmol/L组和阴性对照组3组,保温72 h后,应用RT-PCR和Western blot检测干预后OPG和RANKL mRNA和蛋白水平的表达.结果 二膦酸盐作用于人骨肉瘤细胞株MG-63细胞后,细胞中OPG mRNA和蛋白水平表达升高,RANKLmRNA及蛋白水平则降低(均P＜0.05).结论 二膦酸盐可能通过调节人骨肉瘤细胞株MG-63细胞OPG/RANKL轴的表达,抑制骨肉瘤的溶骨性破坏,对治疗人骨肉瘤有潜在价值.     

新橙皮苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其作用机制

为探讨新橙皮苷对脂肪细胞脂肪形成的影响及其作用机制,采用MTS法检测新橙皮苷对3T3-L1前脂肪细胞的细胞活力的影响,确定新橙皮苷的作用浓度后,油红O染色法和分光光度法测定3T3-L1脂肪细胞的分化及胞内甘油三酯的含量,RT-PCR测定脂肪形成相关基因CCAAT增强子结合蛋白 α(CCAAT/enhancer bind...