Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2.将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子下,得到融合表达载体pYX-XYL2.通过电转化方法将pYX-XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中,酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2得到活性表达,酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0.6 U左右,约为供体菌的2.4倍.与基因供体菌不同,木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导,为组成型表达.     

荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10~6 RLU/mL和1.58×10~9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10~8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。     

树干毕赤酵母和酿酒酵母耦合发酵高浓度混合糖产乙醇

研究在高浓度发酵底物下,不同木糖及葡萄糖之间的比例、P. stipitis CBS5773和S.cerevisiae的发酵先后启动顺序、两菌间的协同发酵对两茵共同发酵混合糖产乙醇的影响.结果表明,乙醇的产量主要来自于由S.cerevisiae消耗葡萄糖而产生,两菌株偶联发酵时,Scerevisiae能较快启动进入产乙醇发酵而不受P. stipitisCBS5773生长的抑制;在高浓度(200 g/L)糖浓度下,S.cerevisiaee和P.stipitis CBS5773存在相互拮抗作用,S.cerevisiae并不完全抑制P. stipitis CBS5773的生长;当木糖与葡萄糖之比为3:2,且S.cerevisiaee和P. stipitis CBS5773分开接入,发酵12 h,乙醇产量最大,达到57 g/L.     

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

Monellin-EGFP 融合蛋白在毕赤酵母中的表达

根据已报道的Monellin甜蛋白氨基酸序列,结合毕赤酵母与桑树密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,并与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因连接,构建融合表达载体。采用电击转化法成功将表达载体导入毕赤酵母GS115中,并获得高效表达的重组子pPIC9K-M-E。经PCR检测,SDS-PAGE和Western Blot杂交证实已表达出融合蛋白,该蛋白经纯化与盲测实验,结果显示其甜度约为标准蔗糖的500倍。     

甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达及应用

巴西甜蛋白(Brazzein)是分离自非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon果实中的一种天然高倍甜味蛋白,具有较好的食品应用潜力。利用毕赤酵母GS115对巴西甜蛋白及蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)进行共表达,重组Brazzein在发酵液中分泌表达量为1 g/L。采用超滤-纳滤膜分离系统和冷冻干燥技术开发重组Brazzein的低成本制备工艺,并完成口感评价,甜度倍数为蔗糖的40倍。同时研究了重组Brazzein对常见致病菌和肠道益生菌的体外抑菌性能,结果表明,重组Brazzein对白念珠菌的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为15 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值为7.5 mg/mL,对桧状青霉的MIC值为3.75 mg/mL,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌没有发现明显的抑菌效果。该研究为Brazzein在甜味剂方面的推广应用提供了理论研究基础。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

毕赤酵母甲酸脱氢酶辅因子特异性改造及应用

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH, EC 1.2.1.2)在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。为了改造巴斯德毕赤酵母甲酸脱氢酶(FDH from Komagataella phaffii,KphFDH)的辅因子特异性并应用于体外NADPH辅因子再生系统,研究基于多序列比对和文献调研的结果,确定了D195、Y196为突变位点,构建了16个突变体,并表征了野生型和突变体的比酶活力和酶促反应动力学。得到最优的NADP⁺特异性突变体为KphFDH^D195Q/Y196R,其对NADP⁺的催化效率(k_cat/K_m)为1.967 L/(mmol·s),催化特异性比率[(k_cat/K_m^NADP+)/(k_cat/K_m^NAD+)]为36.426;以NADP⁺作为辅因子时,对甲酸的催化效率(k_cat<...     

树干毕赤酵母基因组文库的构建及纤维二糖酶基因的筛选

首次构建了树干毕赤酵母DNA基因组文库,该文库包含3 000个克隆,插入片段长度为0.5～8.0 kb。树干毕赤酵母染色体基因为15 441 179 bp,该文库覆盖1.08倍树干毕赤酵母染色体基因,筛选出任一基因或序列的概率为97%。提取文库中的质粒醋酸锂法转化酿酒酵母W303-1A,涂布于纤维二糖为唯一碳源的平板,通过纤维二糖酶对底物纤维二糖的底物特异性筛选文库,首次获得树干毕赤酵母来源的一个1.82 kb的纤维二糖酶基因。     

双孢蘑菇来源非特异性过氧合酶在 毕赤酵母中的表达及生化表征

本研究以来源于(Agaricus bisporus var. bisporus,Abvb)的非特异性过氧合酶AbvbUPO为目标蛋白,实现了其在毕赤酵母GS115中的异源分泌表达。Westernblot检测结果表明重组AbvbUPO分子量为35ku。酶生化表征研究发现,非特异性过氧合酶AbvbUPO的最适反应温度和pH分别为35℃和3.0。通过过氧化氢耐受性实验,发现2 mM以上的过氧化氢会导致AbvbUPO钝化。为保持AbvbUPO在反应过程中的活力,原位生成过氧化氢的AbvbUPO酶级联催化反应被应用于其催化能力的鉴定。以乙基苯为底物的AbvbUPO酶级联催化反应,经过4h的反应后,产物β-苯乙醇的得率可达14.40%。上述研究表明,AbvbUPO是一种不耐受高温和高浓度过氧化氢的中温酶,但在原位生成过氧化氢的级联反应中AbvbUPO可保持良好的催化性能。本研究为非特异性过氧合酶的异源表达和生物催化应用提供了一个良好的借鉴。     

小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

抗生素的过度使用给自然生态带来诸多不利影响,寻找合适的抗生素的替代物,从而减少抗生素的使用正成为当下的研究热点。以来自于小菜蛾的特异性抗菌肽moricin为研究对象,研究其酵母异源表达水平和抑菌性能及生化特性,为进一步的开发利用提供理论支持。根据已有的小菜蛾抗菌肽moricin特异性基因信息,采用聚合酶链式反应扩增其成熟肽基因mor-3,并克隆至pGAPZαA质粒中,构建组成型分泌表达载体pGAPZαA-mor3,线性化片段电转化导入毕赤酵母SMD1168菌株,高质量浓度Zeocin筛选获得高拷贝重组转化子。以YPD为培养基进行摇瓶发酵,重组蛋白获得高效表达,分子质量约为5kD,与理论预测的基本一致;发酵60 h,上清液中重组蛋白表达量达248.98 mg/L,而且耐热性能良好,同时具备较强的耐强酸及强碱的能力,特别在强酸环境中活性保持稳定,体现了较好的机体内环境的适应性潜力;对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用,特别是对革兰氏阴性菌具备特异性较强的抑制作用,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25μg/mL,而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为124.49μg/mL。独特的抑菌性能和理化特点,使其具备广阔的开发应用前景及良好的社会与环保效益。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。     

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

黑曲霉单宁酶基因在毕赤酵母中的表达

单宁酶(EC3.1.1.20)在食品、化工及医药等领域应用广泛,期望通过单宁酶在毕赤酵母中的表达来提高单宁酶的产量。以经室温常压等离子体诱变技术诱变得到的较高产单宁酶的黑曲霉B1401的总DNA为模板,PCR扩增获得单宁酶基因(tan)后构建重组表达载体pPIC9K-tan,通过电转化至毕赤酵母GS115,利用甲醇诱导培养重组菌获得单宁酶。单宁酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为5.0,最高酶活力可达到34.25 U/g,相较于黑曲霉B1401产单宁酶活力提高了1.38倍,Ca~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)等金属离子对重组单宁酶酶活力影响不大。实验结果表明实现了单宁酶在毕赤酵母中的高效表达。     

大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达

本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶AppA基因,并将它克隆到PHKA载体上,在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量,本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法,最终将毕赤酵母中植酸酶的活力从329.41 U/mL提高到了1892.51 U/mL,是初始菌株的5.75倍。初步测定了植酸酶AppA的基本酶学性质,其最适温度和pH分别为60 ℃和4.5;在60 ℃处理60 min后,植酸酶活力剩余40%,温度稳定性较差;在pH 6.0~7.0处理6 h后,酶活力剩余87%,该酶在弱酸环境中有较好的稳定性;同时研究了二价金属离子对植酸酶活力的影响,Fe2+能够激活植酸酶AppA的活力,而Cu2+、Ni2+、Mn2+等离子通过与植酸形成络合物而抑制植酸酶AppA的活力。该酶在酸性条件下的强稳定性有利于将其应用于食品加工领域。     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。