米曲霉原生质体融合条件的优化研究

选取米曲霉A和米曲霉B作为原始亲本菌株,选用纤维素酶、蜗牛酶混合酶解制备原生质体,采用紫外灭活法对原生质体灭活;对原生质体融合率影响较大的PEG浓度、pH值、融合时间三个因素进行正交试验,结果表明:在PEG浓度为35%,pH值为7.5,融合时间为15 min的条件下,原生质体融合率最高,达到7.06%.     

灭活原生质体融合技术提高豆鼓纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG（6000）作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合。通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74·47%和86·36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性。      

灭活原生质体融合技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG(6000)作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合.通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74.47%和86.36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性.     

凝结芽孢杆菌原生质体的制备、再生及灭活

凝结芽孢杆菌是乳酸工业化生产的主要发酵菌株之一,但在发酵结束时,发酵液中往往会残留(6~8)g/L的残糖。为了降低发酵液中的残糖含量,可以通过灭活原生质体融合技术引入外源可降解残糖的酶基因来改善凝结芽孢杆菌降解残糖的能力。以凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)C菌株为供试菌株,考察了酶浓度、酶解温度和酶解时间对凝结芽孢杆菌原生质体制备与再生的影响。结果表明,在菌体OD_(620)为10时,最适的酶解条件为:溶菌酶浓度0.14 mg/mL,酶解温度37℃,酶解时间10 min。在此条件下,原生质体的制备率为95.98%~97.64%,再生率达到13.49%~15.62%。在此基础上,分别考察了紫外致死和高温致死对凝结芽孢杆菌原生质体再生的影响。当紫外照射360 s和70℃高温处理25 min时,原生质体的致死率都能达到100%,这为后续的原生质体融合奠定了基础。     

原生质体融合提高产谷氨酰胺转氨酶菌株产量

目的：研究并建立产谷氨酰胺转氨酶茂原链霉菌原生质体制备技术,通过原生质体融合技术筛选高产菌株。方法：以溶菌酶处理茂原链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合技术,通过96 孔板高通量初筛、试管复筛、摇瓶验证选育高产菌株。结果：茂原链霉菌形成的原生质体再生出的菌落直径比较小,而菌丝生成的菌落直径比较大,两种形态的菌落96 孔板发酵后酶活力有显著性差异。不同的茂原链霉菌株制备原生质体,酶解程度、原生质体纯度、再生率有很大的差异,再生率最高可达1 804.25%,最低仅为12.76%。原生质融合后的高产菌株,选取96 孔板初筛酶活力前3%的菌株进行试管发酵,得到高产菌株比例为32.2%,酶活力比亲本高22.4%,经摇瓶验证产酶比对照提高16.28%。结论：利用基因组重排技术,可以初步对茂原链霉菌进行高产菌株选育。     

土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株

研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法。土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5%溶菌酶,0.3%纤维素酶,0.3%蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5min和4min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30%PEG,0.05mol/LCaCl2,0.05mol/L甘氨酸)介导融合。在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上。双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株。     

原生质体融合法构建增香型苹果酒酿造酵母的研究

以具有强发酵能力的酿酒酵母1605和产香能力好的苹果酒酵母E2为亲本,通过对原生质体融合条件的研究,得出以下结论:根据两亲本的生长曲线图确定两亲本在制备原生质体时的前培养时间为4h;在酶解温度35℃、蜗牛酶终质量分数为1%的条件下,最佳酶解时间为80min,此时,亲本菌株1605的原生质体形成率和再生率分别为92.4%和29.5%,亲本菌株E2的原生质体形成率和再生率分别为93.5%和30.7%;在60℃时,对亲本菌株1605的原生质体水浴灭活15min,即可完全抑制或钝化其原生质体活性。通过对融合子酿造苹果酒的感官和主要香气成分的分析,利用模糊综合评判法优选出8#菌株,该菌株具有产香能力好、发酵能力强的双亲优点,为优良的增香型苹果酒酵母菌株。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226-5、V-20进行抗药性标记,筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17,并以P-67和S-17为融合的亲本在溶菌酶浓度,酶解时间,酶解温度,PEG浓度和pH等不同的条件下进行原生质体融合,从而确定了其融合的最佳条件。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226—5、V-20进行抗药性标记，筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17，并以P-67和S-17为融合的亲本在溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、PEG浓度和pH值等不同的条件下进行原生质体融合，从而确定了其融合的最佳条件。     

高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究

为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究。考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件：不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×106个/mL,再生率最高为6.8%。     

L-缬氨酸产生菌的原生质体融合及抗高糖融合株的筛选

通过原生质体融合技术选育出一株抗高糖的融合株。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NV128和黄色短杆菌(B.flavum)JV16(Leu-Ile-Met-)为亲本菌株,通过单灭活原生质体融合、高糖梯度平板筛选及进一步的硫酸二乙酯(DES)诱变,获得了一株L-缬氨酸高产菌NJ-237。同时研究了影响原生质体形成、再生的3种重要条件(青霉素、酶和渗透压稳定剂),并确定了其最佳处理浓度和时间。该融合株经7 L发酵罐培养72 h L-缬氨酸达到46.8 g/L,糖酸转化率为27.7%,比两亲株都有显著提高。     

采用全基因组改组技术选育蛋白酶高产菌株

为了提高枯草芽孢杆菌B4的蛋白酶产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育,先通过紫外诱变构建了B4菌的突变体库,在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(BRS1、BRS2、BRS5、BRS6)作为亲本,采用PEG介导的方法进行两次多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,共筛选出3株酶活力大幅度提高并能稳定遗传的优良菌株,为BRS1、BRS5、BRS6,酶活力最高达2175.81U/mL,达到原始菌株的3.01倍。     

原生质体融合选育冠菌素高产菌株

研究以抗卡那霉素突变株189(KMr、Glu+)和谷氨酸缺陷营养型突变株A4.6.727(Glu、KM8)为亲本,进行原生质体融合构建冠菌素高产菌株.确定了制备原生质体的适宜条件为溶菌酶浓度0.05mg/mL和酶解时间100min,此条件下原生质体形成率达79.1%,再生率为12.8%.所得融合子经多次转管培养,检测融合子发酵产冠菌素产量,最终筛选到一株高产冠菌素菌株S1893,其冠菌素相对产量比出发菌株提高184.1%和519.0%.     

产番茄红素红酵母基因组重排实验条件的优化

目的:探索基因组重排技术应用于产番茄红素红酵母育种中关键步骤的最优条件。方法:本实验以3株产生番茄红素的红酵母cp-2-11、cp-2-6、cp-28为实验菌株,研究菌体培养时间、酶解浓度、酶解时间、灭活条件以及融合时间对基因组重排的影响。结果:当菌体培养12h,酶解浓度为2%,酶解70min时,原生质体制备与再生率最佳;15W紫外灯,照射距离为35cm,磁力搅拌50r/min的条件下照射18min,60℃下灭活35min作为双亲灭活条件;35%聚乙二醇4000（PEG-4000）作为融合剂,处理23min为最佳融合时间。结论:通过基因组重排最佳条件的确定,后续重排实验的效率得到很大的提升,最终筛选出了高产的目的菌株,产量较融合亲本提高了122%。      

产番茄红素红酵母基因组重排实验条件的优化

目的:探索基因组重排技术应用于产番茄红素红酵母育种中关键步骤的最优条件.方法:本实验以3株产生番茄红素的红酵母ep-2-11、cp-2-6、cp-28为实验菌株,研究菌体培养时间、酶解浓度、酶解时间、灭活条件以及融合时间对基因组重排的影响.结果:当菌体培养12h,酶解浓度为2％,酶解70min时,原生质体制备与再生率最佳;15w紫外灯,照射距离为35cm,磁力搅拌50r/min的条件下照射18min,60℃下灭活35min作为双亲灭活条件;35％聚乙二醇4000(PEG-4000)作为融合剂,处理23min为最佳融合时间.结论:通过基因组重排最佳条件的确定,后续重排实验的效率得到很大的提升,最终筛选出了高产的目的菌株,产量较融合亲本提高了122％.     

白酒酒糟中产纤维素酶菌株的筛选及其酶活力特性检测

以白酒酒糟为原料,通过纤维素酶筛选培养基筛选出酒糟中高产纤维素酶菌株。筛选得到3株产纤维素酶菌株：p1001、p1002、p1004,经鉴定这3株菌分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis),甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。通过研究生长条件对其酶活性的影响,结果显示,这3株菌在55 ℃、pH值为5时酶活性最高,在此条件下p1004的酶活力为1.2 U/mL,约为p1001、p1002的两倍。这对于白酒酿造过程中最大限度利用产纤维素酶菌来提高纤维素的分解和出酒率具有重要的实际应用价值。     

双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究

对双亲灭活米曲霉原生质体融合育种中原生质体制备的条件进行了研究,将菌丝的预处理与细胞壁的酶解合为一步,并讨论了DTT的加入量。结果表明,原生质体制备的最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合浓度比为5:3:1;菌丝培养15h;酶解时加入3mol/L DTT;酶解2.5h;0.8mol/L NaCl作为渗压稳定剂。所得双亲菌株原生质体的融合率为3.31%。     

一株高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的构建

以产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TH-49(Val-)和产α-乙酰乳酸脱羧酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AD-30为亲本菌株,以聚乙二醇为融合促进剂,进行原生质体融合获得融合子,融合子经再生、筛选等过程,最终获得高产3-羟基丁酮菌株HB-32,该菌株3-羟基丁酮产量高达49.64 g/L,比菌株TH-49(Val-)提高了61.8%,且遗传稳定性良好。进一步采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,从分子水平上分析了高产3-羟基丁酮菌株HB-32与亲本菌株基因组的变化。结果表明,枯草芽孢杆菌(B. subtilis)TH-49(Val-)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)AD-30原生质体融合成功,提高了融合子HB-32 3-羟基丁酮产量。     

应用原生质体融合技术筛选豆豉芽孢杆菌

采用原生质体融合技术,以枯草芽孢杆菌Bl⑥为出发菌株,与纳豆芽孢杆菌进行原生质体融合,最终筛选获得融合菌株11株.其中以枯草芽孢杆菌B1⑥和纳豆芽孢杆菌融合获得的RH3519菌株纯种发酵豆豉的品质最佳,且显著优于原始菌株和自然发酵豆豉.RH3519菌株的生理生化鉴定表明,属于芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其遗传稳定性高,发酵不产气,发酵特性可满足工业生产的要求.     

原生质体紫外诱变选育木聚糖酶高产菌株

采用紫外诱变选育木聚糖酶高产菌株,通过对出发菌株Thermomyces lanuginosus DSM10635原生质体形成条件及诱变条件的研究,探索出了其原生质体形成的最适条件:酶系及酶解浓度为0.010g/mL纤维素酶+0.010g/mL蜗牛酶(体积比1:1混合),菌龄58h,酶解时间2.5h,酶解温度30℃~34℃,稳渗剂为0.6mol/L的甘露醇;紫外诱变的最佳条件:距离15W紫外灯30cm处,照射时间5min,通过初筛和复筛,最终选育出3株遗传性能稳定的木聚糖酶高产诱变株,木聚糖酶的酶活分别提高了26.5%、37.78%、28.2%。