中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析

目的:以培菌完成的中高温大曲为样品,分离鉴定耐热细菌并对其风味代谢产物进行分析。方法:通过富集培养和稀释涂布分离、形态学观察及16S r DNA序列分析、生长特性分析,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对其固态和液态发酵产物进行分析。结果:筛选出一株耐热能力较好的细菌NR2,鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）;该细菌培养第4 h开始进入对数生长期,培养24 h达稳定期;液态发酵可以产2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇等风味物质,其中3-羟基-2-丁酮为主要代谢产物;固态发酵代谢产物种类要高于液态发酵,主要是2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪类化合物含量增加。结论:曲香的形成及浓香型白酒风味物质的形成与耐热细菌NR2的代谢特性有关。      

低温大曲真菌菌群结构解析及其风味品质评价

该研究首先使用高通量测序技术解析长治地区低温大曲中真菌的菌群结构,继而使用电子鼻评价大曲的风味品质,最后对真菌菌群与风味品质进行了关联性分析。通过高通量测序可知,在所有大曲样品中均存在且平均相对含量大于1.0%的真菌属有根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、双足囊菌属(Dipodascus)、丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、梗霉属(Lichtheimia)、根毛霉属(Rhizomucor)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)。通过电子鼻检测可知,低温大曲中主要的挥发性物质主要为有机硫化物、萜类物质和乙醇。通过相关性分析可知,在真菌属之间,Lichtheimia与Rhizomucor、Hyphopichia与Saccharomycopsis均呈显著正相关(P<0.05);在真菌属与风味品质之间,Rhizomucor与有机硫化物呈显著正相关(P<0.05),Lichtheimia与芳香类物质呈显著正相关(P<0.05)。由此可见,长治地区低温大曲中含有丰富的真菌类群,并且真菌属与风味品质存在一定的关联性。     

浙江地区中温大曲贮存过程细菌群落多样性及功能预测分析

利用16S rRNA高通量测序和理化分析技术分别解析浙江地区中温大曲贮存过程中细菌群落多样性和理化特征演替,并结合生物信息学方法预测菌群功能。结果表明,大曲贮存90 d后,pH和含水量显著降低（P<0.05）,酸度显著升高（P<0.05）,且贮存前后细菌群落多样性和结构组成差异显著（P<0.05）。乳酸杆菌属（Lactobacillus）和魏斯式菌属（Weissella）是大曲贮存期间的绝对优势属,其相对丰度范围分别为47.56%～63.44%和25.16%～42.77%。魏斯式菌属相对丰度与含水量和pH呈正相关,而酸度与乳酸杆菌属、醋酸杆菌属（Acetobacter）和克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）相对丰度呈正相关。此外,功能预测结果表明中温大曲贮存期间的基因功能主要与代谢、遗传信息处理和环境信息处理等功能相关。     

中温大曲发酵过程中细菌群落结构解析及功能预测

利用高通量测序技术解析了中温大曲发酵过程中的细菌群落结构、功能及表型变化。结果表明:中温大曲细菌群落主要由魏斯氏菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属等组成;基于OTU水平可将中温大曲样品聚类为前期(0 d和3 d)、中期(9 d和13 d)和后期(30 d)3类;发酵前期以葡萄球菌属为主要优势菌,中期以魏斯氏菌属为主要优势菌,后期则以Muribaculum为主要优势菌;中温大曲细菌菌群的氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢等基因功能丰度较高;与发酵中期相比,发酵前期和后期细菌菌群的细胞壁/膜/包膜生物发生、翻译后修饰、蛋白质折叠和伴侣蛋白等基因功能丰度较高;发酵前期大多为兼性厌氧菌,中期以好氧菌为主,后期则主要是厌氧菌。     

襄阳地区高温大曲和中高温大曲真菌多样性解析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对采集自湖北省襄阳市某酒厂的高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构进行解析。结果表明,高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（57.43%）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）（30.73%）为主,而中高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（48.05%）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）（17.72%）和曲霉菌属（Aspergillus）（14.56%）为主。虽然两类大曲共有核心操作分类单元（OUT）包含的序列数占总序列数的64.21%,但经主坐标分析（PCoA）和聚类分析（CA）发现两类大曲在空间排布上呈现明显分离趋势。经线性判别分析效应量（LEfSe）分析发现,导致两类大曲真菌群落结构存在差异的菌属为嗜热真菌属（Thermomyces）。一些真菌类群在高温大曲和中高温大曲中均存在,但两类大曲亦具有各自较为独特的真菌类群。     

中温大曲中一株高温霉菌的分离与鉴定

自中温大曲中分离了一株能在６０－６２℃生长良好的耐高温霉菌。经测定，该菌产生孢囊孢子，形成与孢囊梗对生的假根；同化纤维二糖等１５种碳源，硝酸钾等氮源；耐４６％的葡萄糖、１２％的ＮａＣｌ；在ＰＨ１．８－９．２间均能良好生长。     

酱香型大曲细菌的多样性

以酱香型大曲为研究对象,研究酱香型大曲细菌种群多样性及功能基因预测。分别采用可培养稀释平板法以及高通量测序方法分析大曲细菌群落组成,并结合功能基因筛选及高通量测序分析等宏基因组学研究手段,预测其相关基因功能。大曲细菌总数范围在106~108CFU/g,可培养法分离到的51株Bacillus sp.,1株Acinetobacter sp.。确定酱香型大曲细菌的主体类群组成为以厚壁菌门(87.3%~91.8%)为主要类群,其次是放线菌门(3.3%~9.1%),并发现了未曾报道过的蓝细菌门Cyanobacteria(0.1%~1.5%)。确定了以Thermoactinomyces sp.和Bacillus sp.为主的酱香型大曲细菌群落结构组成,其相对含量占细菌总量的60%以上。通过第二代高通量测序方法还对大曲样品中细菌的代谢功能基因进行了预测。     

清香型白酒酿酒大曲微生物菌群多样性解析

采用高通量测序技术对清香型堡子酒酿酒大曲样品的16S rRNA V3-V4区和ITS1-ITS2区基因序列进行测序,解析大曲微生物菌群多样性。结果表明,大曲样品中的细菌、真菌操作分类单元（OTU）数分别为124、48,细菌菌群丰富度、多样性和均匀程度较真菌高。优势细菌门（相对丰度＞1%）主要有变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）等,优势细菌属（相对丰度＞1%）主要有泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、雀麦属（Bromus tectorum）等。绝对优势真菌门（相对丰度＞90%）为子囊菌门（Ascomycota）,第一优势真菌属（相对丰度＞50%）为孢圆酵母属（Torulaspora）。细菌蛋白功能主要集中在氨基酸转运与代谢、转录、碳水化合物转运和代谢等;真菌共鉴定出2个营养型和2种混合营养型,以及4个单一生态功能群和9个混合生态功能群。     

中高温大曲中产酯酶细菌的筛选

通过在培养基中添加底物三丁酸甘油酯,从中、高温大曲中初步筛选到产酯酶细菌15株.以乙酸对硝基苯酯为底物,其中12#菌株表现出最高催化活力其酶活为0.83U/mL;以乙醇、己酸为底物,其中10#菌株表现出最高催化活力其酶活为6.7U/mL.对上述两种测定方法中相对酶活较高的菌株恒温振荡培养(36℃、150r/min) 72h后取其发酵液离心(12000r/min,4℃)20min进行气相色谱分析,结果表明这些菌株都能产生一定量的酸类、醇类和酯类物质.     

滨州地区高温和中温大曲真菌类群解析及其感官品质关联性分析

为了解析山东滨州地区不同类型大曲真菌群落结构及其感官品质之间的差异,本研究采用高通量测序、电子鼻和电子舌技术对滨州地区高温和中温大曲真菌群落结构和品质特征进行了综合分析。研究结果表明,高温大曲真菌物种多样性和丰富度非常显著低于中温大曲（P<0.01）,且两种大曲之间真菌群落结构存在显著差异（P<0.05）,其中嗜热真菌属（Thermomyces）在高温大曲中平均相对含量显著偏高（P<0.05）,曲霉属（Aspergillus）、根霉属（Rhizopus）、根毛霉属（Rhizomucor）和横梗霉属（Lichtheimia）在中温大曲中平均相对含量显著偏高（P<0.05）,Thermomyces和威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）可以分别作为高温和中温大曲的生物标志物,且高温大曲真菌微生物网络稳定性弱于中温大曲。此外,两种大曲之间风味品质差异不显著（P>0.05）,而滋味品质差异非常显著（P<0.01）,苦味和鲜味的回味在高温大曲中显著偏低（P<0.05）,酸味、咸味和苦味的回味在中温大曲中显著偏低（P<0.05）,且大曲优势真菌属与风味指标之间关联性不显著（P>0.05）,与滋味指标之间关联性非常显著（P<0.01）,其中Thermomyces与酸味、涩味和苦味的回味呈现正相关,与鲜味和鲜味的回味呈现负相关,而Aspergillus、Rhizopus、Rhizomucor、Rasamsonia和Lichtheimia则与之相反。由此可见,滨州地区高温和中温大曲之间真菌群落结构和滋味品质存在差异,且优势真菌属与滋味指标之间具有关联性。     

大曲中可培养霉菌多样性的分子分析

从中温大曲中分离98株霉菌进行纯培养,通过形态和培养特征初步分析后得到6个不同的类群,从各类群中随机选取1个代表菌株进行5．8S-ITS序列分析和系统发育分析。结果表明,分离的菌株分布在Monascus属、Eurotium属、Rhizopus属、Cladosporium属、Penicillium属、Absidia属等6个已知真菌属,揭示了中温大曲中霉菌的多样性。     

中温大曲中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选鉴定及培养条件优化

为了获得高产淀粉酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）,该研究采用稀释平板法和划线法从中温大曲中分离纯化芽孢杆菌,通过透明圈法初筛和3,5二硝基水杨酸（DNS）法复筛,获得高产淀粉酶芽孢杆菌,并采用形态学观察和16S r RNA同源序列分析方法进行菌种鉴定。以淀粉酶活力为响应值,采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验对筛选菌株的培养条件进行优化。结果表明,共分离纯化出72株芽孢杆菌,从中筛选得到一株淀粉酶活力最高的芽孢杆菌菌株,编号为ZTW17-6,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;其最佳培养条件为乳糖50 g/L、蛋白胨60 g/L、接种量5%、发酵温度35℃、转速180 r/min、装液量76 m L/250 m L、初始pH值7。在此优化条件下,淀粉酶活力达到8 352.95 U/m L,是优化前的2.61倍。     

临沂和周口地区中高温大曲细菌群落结构与基因功能差异性研究

为明确山东临沂和河南周口地区中高温大曲细菌群落结构及菌群基因功能的差异,本研究采用MiSeq高通量测序技术对2个地区中高温大曲的细菌群落结构进行了解析,并基于直系同源蛋白数据库（clusters of orthologous groups of proteins,COG）分析了其细菌类群潜在的功能。α多样性发现,两者在丰富度和多样性上差异均不显著（P>0.05）。相较于周口地区大曲,在门水平上,临沂地区大曲中放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）平均相对丰度均显著偏低（P<0.05）,在属水平上,不动杆菌属（Acinetobacter）平均相对丰度显著偏高（P<0.05）,地杆菌属（Geobacter）和泛菌属（Pantoea）平均相对丰度均显著偏低（P<0.05）。LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析发现,Geobacter为周口地区大曲中的生物标志物,而临沂地区大曲中的生物标志物未在属水平体现;β多样性发现,两者在整体上存在明显差异;PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）分析发现,临沂地区中高温大曲在转录、氨基酸和核苷转运与代谢功能上显著高于周口地区大曲（P<0.05）。由此可见,2个地区中高温大曲的细菌群落结构及菌群基因功能表达均存在明显差异。     

中温大曲中乳酸菌的分离鉴定及产酸特性

对宋河中温酒曲中的乳酸菌进行分离鉴定并研究产酸特性。共分离得到19株乳酸菌,初步鉴定了4个属8个种的16株乳酸菌,4个属分别为微球菌属、片球菌属、链球菌属和乳杆菌属,8个种分别为藤黄微球菌（M．Luteus）、皱褶微球菌（M．Colpogenes）、变异微球菌（M.Varians）、乳酸片球菌（（P.Acidilactici）、戊糖片球菌（P.Pentosaceus）、乳链球菌（S．Lactis）、乳酸乳杆菌（L．Lactis）和短乳杆菌（L.Brevis）。微球菌和片球菌是宋河中温大曲中的优势乳酸菌。14株乳酸菌的产酸特性可分为两种类型：一类是乳酸菌在37℃发酵12h时,pH值可达到最小值,此后逐渐上升;另一类是乳酸菌37℃发酵12h,pH值迅速下降,24h可达到最小值,此后逐渐趋于平缓。     

中高温大曲中芽孢杆菌多样性及代谢特征研究

为探究大曲中芽孢杆菌的代谢特征和功能性,首先采用传统培养法结合分子生物学技术从中高温大曲中分离、鉴定芽孢杆菌,对其微生物多样性进行分析;然后通过耐受性分析从中筛选优势菌,最后利用代谢组学方法分析其代谢特性。结果表明,共分离、鉴定得到49株芽孢杆菌,其中3株芽孢杆菌耐受性较好,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-5、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-7和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV-10。从单菌株及混合菌株发酵后的发酵液中共检测到23种挥发性代谢物和52种非挥发性代谢物,其中,愈创木酚以菌株BS-7单独培养时含量最高,为8.56 mg/L。同时芽孢杆菌混合发酵会增加4-乙烯基愈创木酚的生成量,在菌株BV-10和BA-5混合培养后,达到104.47 mg/L,说明芽孢杆菌单菌株及种间协同作用对白酒酿造中的特征物质形成具有重要影响。     

高温大曲中芽孢杆菌菌群多样性解析及其分离株鉴定

为探究湖北襄阳地区高温大曲中芽孢杆菌（Bacillus）菌群多样性,该研究通过下载并筛选高温大曲样品芽孢杆菌相对含量>2.0%的测序数据,采用Illumina Mi Seq高通量测序技术和传统纯培养技术相结合的方法对大曲样品中芽孢杆菌多样性进行解析。结果表明,高温大曲中芽孢杆菌相对含量>2.0%的样品共有12份,包括8份白色大曲样品和4份黄色大曲样品,所有样品共获得77 825条代表性序列,1 197个操作分类单元（OTUs）。多样性分析结果表明,较之黄色大曲,白色大曲样品中芽孢杆菌的超1指数和发现物种数显著偏高（P<0.05）。OTU分析结果表明,OTU5321和OTU5291在所有样品中均存在,其在白色大曲和黄色大曲中累积包含序列分别占总序列数的49.43%和41.32%。传统纯培养技术分析结果表明,解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为高温大曲中芽孢杆菌的主要可培养菌种。由此可知,白色大曲芽孢杆菌群落结构的丰富度更高,且解淀粉芽孢杆菌为高温大曲中芽孢杆菌的主要可培养菌种,为后续高温大曲中芽孢杆菌的应用及菌种选育具有指导作用。     

河套地区中温大曲真菌类群与理化指标关联性分析

为分析河套地区中温大曲真菌类群及其理化特性,该研究使用MiSeq高通量测序技术对采集自河套地区的中温大曲真菌群落进行解析,样本中平均相对含量>1%的真菌属有7个,分别为嗜热真菌属(Thermomyces)、曲霉属(Aspergillus)、节担菌属(Wallemia)、横梗霉属(Lichtheimia)、根毛霉属(Rhizomucor)、双足囊菌属(Dipodascus)和根霉属(Rhizopus)。理化分析表明,样品间糖化力和酯化力波动较大。关联分析表明,Lichtheimia和Dipodascus均与大曲液化力及糖化力呈显著正相关(P<0.05),Dipodascus亦与水分含量间呈显著相关性(P<0.05);Wallemia与大曲发酵力呈显著正相关(P<0.05),而Rhizomucor不利于该地区中温大曲酒化力形成(P<0.05)。同时,该研究从样品中分离出2株酵母菌,经鉴定均为扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。综上表明,河套地区中温大曲中含有丰富的真菌类群和一定数目的可培养S.fibuligera,且部分真菌...     

大曲微生物群落结构及其风味组分相关性研究

为探讨中高温大曲主要微生物与挥发性风味物质的相关性,进一步明确大曲对白酒酿造过程的重要意义,本研究利用高通量测序技术、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）技术分析了不同时期中高温大曲微生物群落结构组成及挥发性风味物质的动态变化,并用Spearman相关系数探究了微生物与挥发性风味物质间的相关性。结果表明,从4个大曲样品中共检出3个优势细菌门和17个优势细菌属,3个优势真菌门和11个优势真菌属,不同时期大曲样品共有优势细菌属为明串珠菌属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）等,共有优势真菌属为毛霉属（Rhizomucor）、假丝酵母属（Candida）;从4个大曲样品中共检出醇类、酸类、醛酮类、吡嗪类、酯类、芳香类、萜烯类等56种挥发性风味物质;相关性结果表明,Fructilactobacillus、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）与糠醛、2-吡咯甲醛等醛酮类呈极显著正相关,芽孢杆菌属与吡嗪类呈极显著相关（P<0.01）,假丝酵母属、根霉属（Rhizopus）和毕赤酵母属（Pichia）分别与芳香类、醇类和酯类呈显著性相关（P<0.05）。     

兰陵浓香大曲理化性质和细菌群落多样性研究

该研究对山东兰陵浓香大曲的理化性质和细菌菌群多样性进行解析,并结合传统纯培养技术、形态观察及分子生物学技术对其蕴含的细菌菌株进行分离鉴定。结果表明,兰陵大曲样品的淀粉含量、蛋白质含量、糖化力、酯化力、酒化力和液化力均符合QB/T 4259—2011《浓香大曲》要求。兰陵大曲优势细菌门（平均相对含量>1.0%）为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）,优势细菌属（平均相对含量>1.0%）为芽孢杆菌属（Bacillus）(79.86%)、不动杆菌属（Acinetobacter）(9.71%)和高温放线菌属（Thermoactinomyces）(3.97%);基于纯培养技术从中共分离鉴定出16株芽孢杆菌和3株乳酸菌,包括7株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、4株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、2株澳洲芽孢杆菌（Bacillus australimaris）、2株副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）、1株西姆芽孢杆菌（Bacillus siame...