鲟鱼皮二肽基肽酶-IV抑制肽咀嚼片的制备工艺优化

针对市场上含有鲟鱼皮二肽基肽酶-IV （Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制肽咀嚼片的相关产品较少的问题,采用湿法造粒技术和模糊数学法分析方法及单因素实验、响应面试验及正交试验,对咀嚼片配方及制备工艺进行优化。结果表明:咀嚼片最优配方为肽粉添加量46.52%,木糖醇添加量23.94%,CMC-Na添加量7.88%,硬脂酸镁添加量7.00%,奶粉及微晶纤维素添加量分别为10%与4.66%;在转台速度20 r/min,充填深度11 mm,充填压力28 kN,原料粒度350目的制备条件下,制得的咀嚼片硬度适中,表面光滑且色泽均匀,模糊数学分析法综合得分为69.75分。本研究通过辅助加料配合湿法造粒技术,对鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片的配方及制备工艺进行优化,旨在为咀嚼片产品的制备提供理论支持。     

猪皮胶原ACE抑制肽的纯化与鉴定

采用超声协同稀碱对猪皮实施预处理后,酶解30 min制得的高血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性水解液为原料,采用Sephadex G-15、半制备高效液相色谱分离纯化其中胶原ACE抑制肽并对其序列进行鉴定。结果表明,Sephadex G-15分离胶原ACE抑制肽的最佳分离条件为:样品浓度100 mg/m L;上样量2 m L;流速2 m L/min;洗脱剂为蒸馏水;层析柱为1 m×10 mm的层析柱。在该分离条件下,混合肽被分成AP-I、AP-II两个组分,IC50值分别为19.50、1.01 mg/m L。对抑制活性较强的AP-II进一步采用半制备高效液相色谱进行分离,得到8个组分峰,其中峰2、峰5和峰6的IC50值最小,分别为0.73、0.44和0.4 mg/m L。结合IC50值的大小及半制备收集到样品的量,对峰2和峰6采用LC-MS/MS进行序列分析。结果显示峰2的多肽序列为QGPPGPAGPR(P为Hyp),峰6的序列为AGPPGPPGPA,这两个序列位于胶原蛋白α1链中526?535、730?739位。     

芝麻抗氧化肽分离纯化与结构鉴定

通过纳滤、超滤、制备液相对胰蛋白酶水解芝麻蛋白的酶解液中抗氧化肽进行分离纯化,随后采用高效液相质谱联用法进行结构鉴定,并合成相应多肽验证抗氧化活性。结果表明,经分离纯化与结构鉴定,共获得5个芝麻抗氧化肽,Glu-Leu-Phe-Phe-Gly-Ala-Gly-Gly- Glu-Asn-Pro-Glu-Ser-Phe-Phe-Lys(ELFFGAGGENPESFFK)、Phe-Glu-Ser-Glu-Ala-Gly-Leu- Thr-Glu-Phe-Trp-Asp-Arg(FESEAGLTEFWDR)、Asp-Val-Ala-Asn-Glu-Ala-Asn-Gln-Leu-Asp- Leu-Lys(DVANEANQLDLK)、Glu-Asn-IIe-Glu-His-Thr-Ala-Ala-Thr-His-Ser-Tyr -Asn-Pro- Arg(ENIEHTAATHSYNPR)、Gln-Asp-Asn-Ala-Asn-Asn-Ala-Asn-Gln-Leu-Asp-Pro-Asn-Pro- Arg(QDNANNANQLDPNPR)。胰蛋白酶酶解产生的芝麻抗氧化肽N端以酸性氨基酸残基为主,C末端为碱性氨基酸残基;除抗氧化肽ELFFGAGGENPESFFK是芝麻7S酶解产物以外,其余多肽均来自芝麻11S蛋白酶解。     

抗氧化黑豆肽的分离纯化与结构鉴定

以氧自由基清除能力(ORAC)为评价指标,通过超滤与大孔树脂吸附、乙醇分级洗脱对黑豆蛋白酶解产物进行初步分离,采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱(RP-HPLC)与排阻色谱(SEC)逐级纯化,最终得到RP-HPLC P2组分SEC P2肽段和RP-HPLC P4组分SEC P3肽段2个纯化多肽,质量浓度为1 mg/mL的2个纯化多肽的ORAC值(Trolox当量)分别为307.5和314.6μmol/L,其氧自由基清除能力分别是超滤分离抗氧化最强黑豆肽组分(Mr1 000)的2.68和2.74倍,经Edman降解、N-端测序进行结构鉴定,纯化后的2个抗氧化肽段的氨基酸组成序列结构分别为Tyr-Asn-Ile和Trp-Asn-Pro,N-端分别为具有酚羟基结构的酪氨酸Tyr和疏水性很强的色氨酸Trp。     

鲟鱼皮中二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与鉴定

为从鲟鱼皮中分离提取出二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,以鲟鱼皮胶原蛋白为主要材料,利用蛋白酶进行酶解,以DPP-IV抑制率为主要考察指标,在单因素试验的基础上,进一步利用响应面法优化了鲟鱼鱼皮中DPP-IV抑制肽的制备工艺条件,确定最佳酶解条件为：酶解温度50?℃、料液比1∶100（g/mL）、pH?6.12、加酶量10?170.35?U/g、酶解时间12.12?h。在此基础上,通过超滤、凝胶层析及反相高效液相色谱的方法对酶解产物进行分离纯化;采用液相色谱-串联质谱法对多肽进行鉴定,结果显示纯化后具有DPP-IV抑制活性肽氨基酸组成为：甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸（GPSGLDGAK）,IC50值可达（61.27±1.16）μmol/L。本研究结果可为利用鲟鱼皮生产新型的生物活性成分提供参考。     

海参二肽基肽酶Ⅳ抑制肽的酶解制备及结构鉴定

通过抑制二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV, DPP-IV)的活性,从而减少GLP-1的降解,提高血液中胰岛素的水平,是控制血糖水平的一种重要手段。本文以海参(Holothariatubulosa)为原料,通过探究蛋白酶种类、加酶量和酶解时间对酶解产物DPP-IV抑制活性、蛋白回收率和水解度的影响,确定了海参DPP-IV抑制肽的制备条件,并进一步测定了其分子量分布和总氨基酸组成,最后通过UPLC-MS/MS鉴定了其潜在的活性肽序列。结果发现,木瓜蛋白酶与复合蛋白酶1:1的复配酶解具有最佳的酶解效果,其产物的得率和DPP-IV抑制活性均最高,且在加酶量为干海参质量的1%,酶解时间为4 h时,海参酶解产物在终浓度为2 mg/mL时的DPP-IV抑制率为66.97%,蛋白回收率为76.25%,水解度为6.10%。酶解产物的分子量大都小于5000 u,且富含脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)等与抑制DPP-IV活性有关的氨基酸。将获得的酶解物中的肽段进行液质联用检测,并通过Mascot分析筛选得到28条具DPP-IV抑制肽的肽序列,分子量在500～1936 u。本实验结果为以海参为原料进行降血糖产品的开发奠定了基础。     

大豆低聚肽中抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

为考察大豆低聚肽中抗氧化肽的活性和结构,以大豆分离蛋白为原料,采用两步酶解法制备出大豆低聚肽,在对其理化成分进行分析的基础上,以DPPH自由基清除能力为指标对其抗氧化活性进行了评价。结果表明:大豆低聚肽的DPPH自由基清除活性的IC50值约为2.6 mg/m L。利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对大豆低聚肽进行分离纯化,收集6个组分峰,对其DPPH自由基清除能力进行了测定。结果表明,6个组分的活性均比大豆低聚肽高。最后利用Q-TOF质谱仪对活性最高的组分5#进行了结构鉴定,并对鉴定出的6个肽段的DPPH自由基清除活性进行了评价。结果表明,6个肽段均有一定的DPPH自由基清除能力,其中Leu-Tyr(LY)、Leu-Ala-Gly-Arg(LAGR)、Phe-Ser-Arg(FSR)的清除率比大豆低聚肽高,是具有较高抗氧化活性的肽段。     

大鳞副泥鳅蛋白ACE抑制肽的分离纯化与鉴定

目的:开发大鳞副泥鳅的ACE抑制肽。方法:采用超滤、葡聚糖凝胶(Sephadex G-15)和半制备型高效液相色谱等多种技术,从大鳞副泥鳅蛋白酶解产物中分离纯化制备了高活性的ACE抑制肽,并利用高效液相色谱质谱—串联质谱对其结构进行解析;利用抑制动力学分析纯化后ACE抑制肽的抑制模式。结果:高活性ACE抑制肽的氨基酸序列为Glu-Gly-His,相对分子质量345.2 Da, IC₅₀值为(17.89±3.28)μg/mL,纯化倍数为27.47。结论:大鳞副泥鳅抑制肽是一种竞争性的ACE抑制肽。     

源于鸡蛋清溶菌酶ACE抑制肽的分离纯化及结构鉴定

利用胃肠消化酶系水解疏水性氨基酸含量高的蛋清溶菌酶蛋白,筛选能抗胃肠消化的高活性ACE抑制肽。通过超滤、制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)、分析型RP-HPLC纯化、氨基酸组成分析及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS),从胃肠消化水解液中分离鉴定出两种ACE抑制肽Lys-Val-Phe(KVF)和Trp-Ile-Arg(WIR),化学合成该两种三肽后,ACE抑制活性测定结果显示其IC50值分别为14μmol/L与88.5μmol/L。研究结果表明,蛋清溶菌酶蛋白来源的ACE抑制肽有望用于高血压的预防与治疗。     

源于鸡蛋清溶菌酶ACE抑制肽的分离纯化及结构鉴定

利用胃肠消化酶系水解疏水性氨基酸含量高的蛋清溶菌酶蛋白,筛选能抗胃肠消化的高活性ACE抑制肽。通过超滤、制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）、分析型RP-HPLC纯化、氨基酸组成分析及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）,从胃肠消化水解液中分离鉴定出两种ACE抑制肽Lys-Val-Phe（KVF）和Trp-Ile-Arg（WIR）,化学合成该两种三肽后,ACE抑制活性测定结果显示其IC50值分别为14μmol/L与88.5μmol/L。研究结果表明,蛋清溶菌酶蛋白来源的ACE抑制肽有望用于高血压的预防与治疗。      

乌鸡低聚肽铁的分离纯化及结构鉴定

为了考察乌鸡低聚肽铁中肽段的结构,以乌鸡为原料,以氯化亚铁为铁源制备乌鸡低聚肽铁,对其总蛋白质质量分数、螯合率、得率进行测定,结果表明乌鸡低聚肽铁总蛋白质质量分数为(56.79±0.18)%,螯合率为(83.53±0.15)%,得率为(40.86±0.14)%。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进行分离纯化,收集4个组分峰,利用四极杆飞行时间串联质谱仪(QTOF质谱仪)测定肽序列,分析出1个肽段,氨基酸序列为Thr-Ser-Gly-Met-Pro,相对分子质量为491.56。     

蛋清抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

为了获得高活性、高纯度的蛋清抗氧化肽,以蛋清酶解物为原料,依次釆用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱分离纯化抗氧化活性较强的肽段,运用基质辅助激光解吸离子化质谱解析肽链的氨基酸序列。结果表明:超滤法分离纯化EWPH所得的三个组分中,EWPH-Ⅲ(M_W<3 kDa)组分的DPPH自由基清除率最高,达到79.62%。离子交换层析分离纯化EWPH-III所得到的碱性组分B的DPPH自由基清除率最高,达到82.05%。凝胶过滤色谱分离EWPH-III-B所得到4组分中E组分的DPPH自由基清除率最高,为88.49%。高活性高纯度EWPH-III-B-E组分的相对分子质量为237.575,该二肽的氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸。     

榛仁免疫活性肽分离纯化及结构鉴定

以榛仁分离蛋白水解肽经超滤获得的分子质量小于3 kDa的组分为研究对象,采用凝胶色谱及反相高效 液相色谱对其进行分离纯化,并对所得组分进行结构鉴定和验证。结果显示：经Sephadex G-15分离得到的组分B1 能极显著降低小鼠RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子和白介素-6水平（P＜0.01）;经质谱解析筛选出的肽段Pro-Glu- Asp-Glu-Phe-Arg（PEDEFR）对细胞无毒性作用,高浓度PEDEFR（＞50 μmol/L）能提高小鼠RAW264.7巨噬细胞吞噬能 力;当浓度达到100.0 μmol/L时,促进脾淋巴细胞增殖率达到44.21%,在伴刀豆蛋白A共同作用下,增殖率达到53.22%。 PEDEFR对小鼠RAW264.7巨噬细胞具有较好的免疫调节能力,本研究为榛仁免疫活性肽的开发提供了理论依据。     

海洋骨胶原低聚肽钙的分离纯化及结构鉴定

以三文鱼骨作为原料,以碳酸钙作为钙源制备出海洋骨胶原低聚肽钙,对其总蛋白含量、螯合率、得率进行测定,结果表明总蛋白含量为62.56%±0.26%,螯合率为51.38%±0.09%,螯合物得率为42.06%±0.10%。然后利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对其进行分离纯化,收集得到8个组分峰,利用Q-TOF质谱仪测定肽序列,共分析出22个肽段,分子量大多在1000 u以下。      

红松仁清蛋白ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定

为研究酶解红松仁清蛋白中具有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性短肽的组分及其序列,采用超滤、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色谱对松仁清蛋白酶解液进行分离纯化,对纯化后样品(组分D2)进行质谱结构鉴定。质谱结果进行从头测序,筛选得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys(YLLK),分子质量为535.34 D。该肽经固相合成纯度为99.80%,其半数抑制浓度测定值为0.282 5 μmol/L。     

松仁清蛋白抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

利用碱性蛋白酶酶解松仁清蛋白制备高抗氧化活性肽,通过超滤、SephadexG-25、SephadexG-15及反相高效液相色谱对抗氧化肽进行分离纯化,并采用电喷雾串联质谱进行结构鉴定。经筛选获得高抗氧化活性肽苯丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸（FFPY）和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（YLPF）,分子质量分别为572.67 Da和538.65 Da。对FFPY和YLPF进行固相合成,纯度达到99.16%和99.91%,氧自由基吸收能力分别为7 329.63 μmol/g和2 835.47 μmol/g。     

深海鲑鱼皮来源ACE抑制肽的分离及鉴定

为了考察海洋胶原低聚肽中ACE抑制肽的活性和结构,本文以深海鲑鱼皮为原料,采用两步酶解法制备出海洋胶原低聚肽,在对其分子量分布进行分析的基础上,测定了其血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明,海洋胶原低聚肽中分子量小于1000 u的组分高达90.79%,主要分布在132~576 u范围内,其ACE抑制活性的IC50为1.18±0.12 mg/m L。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对海洋胶原低聚肽进行分离纯化,收集11个组分峰,对其ACE抑制活性进行了测定。结果表明,有7个组分的ACE抑制活性比海洋胶原低聚肽高。最后利用Q-TOF质谱仪对收集的11个组分进行了结构鉴定,并对鉴定出的15个肽段进行了ACE抑制活性测定。结果表明,15个肽段均有一定的ACE抑制活性,其中Ala-Pro(AP)、Val-Arg(VR)、Gly-Arg(GR)的ACE抑制率比海洋胶原低聚肽高,IC50值分别为0.07±0.01 mg/m L、0.35±0.03 mg/m L、0.92±0.85 mg/m L,活性大约是海洋胶原低聚肽的16.86、3.37、1.28倍,是具有较高ACE抑制活性的肽段。     

硫酸软骨素肽的分离纯化和鉴定

本文直接用木瓜蛋白酶提取软骨硫酸软骨素肽,采用表面活性剂和三氯乙酸除蛋白质,乙醇沉淀多糖,透析,DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析,从软骨中分离得到多糖肽,经红外光谱和琼脂糖电泳证明主要成分为硫酸软骨素肽,高效液相色谱和琼脂糖电泳证明该产品均一,纯度达到99.09%,相对分子量为75174Da,氨基酸平衡,呈味氨基酸较多。     

花生ACE抑制活性肽的分离纯化与结构鉴定

本实验研究了花生水酶法提油中的另一产物--花生肽的抑制血管紧张素转换酶(Angiotcnsin converting enzyme,ACE)活性,并对其中ACE活性抑制率最高的肽进行了分离纯化和结构鉴定.该组分的氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr.     

降胆固醇亚麻籽蛋白酶解肽的分离纯化及结构鉴定

采用Protease M对亚麻籽蛋白进行酶解,制备具有降胆固醇活性的亚麻籽蛋白酶解肽,对其进行分离纯化及结构鉴定,并合成相应多肽验证其降胆固醇活性。结果表明,经Protease M对亚麻籽蛋白酶解4 h时获得的亚麻籽蛋白酶解肽胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为47.57%;继续采用超滤技术将其分离为相对分子质量小于等于3 kDa、3~5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa和大于30 kDa 5个组分,发现相对分子质量小于等于3 kDa的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为71.0%;再经大孔树脂对该组分进行吸附后经过不同体积分数乙醇溶液洗脱,发现75%的乙醇洗脱分离得到的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为79.8%;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对其进一步分离纯化,收集到F9组分的胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为85.7%;最后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)从F9组分中鉴定出6种降胆固醇亚麻籽肽,氨基酸序列分别为Ile-Ile-Pro-Ala-Phe(IIPAF)、Leu-Asn-Phe-Phe(LNFF)、Leu-Leu-Gly-Thr-Leu(LLGTL)、Ile-Pro-Pro-Phe(IPPF)、Ile-Ile-Phe(IIF)和Leu-Leu-Gly-Ala(LLGA),其胆固醇胶束溶解度抑制率分别为82.8%、77.8%、88.0%、93.5%、80.3%和87.1%。