溶氧量对酿酒酵母及其工程菌的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应

目的:研究溶氧量对酿酒酵母S288C及工程菌ARO8-10的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应。方法:在5 L发酵罐中装液量60%,控制p H 5.0,温度30℃,通气比0.5~2.0 vvm,定时取样检测发酵液生物量、β-苯乙醇、L-苯丙氨酸转化率以及菌体相关代谢酶活性等。结果:通气条件在0.5~2.0 vvm范围时,野生型菌株S288C的生物量、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)酶活力明显高于转氨酶基因ARO8与脱羧酶基因ARO10耦合过表达工程菌ARO8-10;ARO8-10的β-苯乙醇发酵产量、L-苯丙氨酸转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶、G6PD、GK及PDC酶活力均明显高于S288C(P≤0.01)。在1.0 vvm通气条件发酵60 h时,ARO8-10的发酵液中葡萄糖已基本用尽,β-苯乙醇产量达到2.68 g/L,L-苯丙氨酸转化率达到47.3%,较S288C分别提高了44.4%和12.4%。1.0 vvm为β-苯乙醇发酵较适宜的通气条件。结论 :酿酒酵母的β-苯乙醇代谢与艾利希途径、莽草酸途径、EMP、PPP途径TCA循环等密切相关,构成其合成代谢网络,代谢途经多种酶相互影响;ARO8和ARO10基因耦合过表达,增强了L-苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙酮脱羧酶活力,有利于提高G6PD、GK及PDC酶活力,β-苯乙醇代谢流量及产量。     

脱羧酶基因ARO10的过量表达及其对Saccharomy cescerevisiae的β-苯乙醇合成代谢影响

为了验证脱羧酶在S.cerevisiaeβ-苯乙醇合成途径中的调控作用,本文从S.cerevisiae S288C中克隆脱羧酶基因ARO10,并构建由3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1组成型强启动子控制的ARO10基因表达载体pYES2-Ppgk-ARO10,将重组载体导入S.cerevisiae S288C,研究ARO10基因过量表达对重组菌株中β-苯乙醇合成的影响。经摇瓶实验测定,携带pYES2-Ppgk-ARO10的转化子SP10在发酵60h时β-苯乙醇产量达到最大量1.0g/L,较野生型的对照菌提高16.3%。研究结果表明,脱羧酶是S.cerevisiae S288C中β-苯乙醇生物合成途径的关键酶之一,增加ARO10基因表达量有利于提高β-苯乙醇产量,研究为构建β-苯乙醇高产工程菌株奠定了重要基础。     

脱羧酶基因ARO10的过量表达及其对Saccharomy cescerevisiae的β-苯乙醇合成代谢影响

为了验证脱羧酶在S.cerevisiaeβ-苯乙醇合成途径中的调控作用,本文从S.cerevisiae S288C中克隆脱羧酶基因ARO10,并构建由3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1组成型强启动子控制的ARO10基因表达载体pYES2-Ppgk-ARO10,将重组载体导入S.cerevisiae S288C,研究ARO10基因过量表达对重组菌株中β-苯乙醇合成的影响。经摇瓶实验测定,携带pYES2-Ppgk-ARO10的转化子SP10在发酵60h时β-苯乙醇产量达到最大量1.0g/L,较野生型的对照菌提高16.3%。研究结果表明,脱羧酶是S.cerevisiae S288C中β-苯乙醇生物合成途径的关键酶之一,增加ARO10基因表达量有利于提高β-苯乙醇产量,研究为构建β-苯乙醇高产工程菌株奠定了重要基础。      

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

蔗糖利用型毕赤酵母工程菌的构建

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近20年来应用最广泛的真核表达系统之一,已有500多种蛋白在该系统得到了成功表达,然而在毕赤酵母基因组中却缺少蔗糖酶基因,因此无法利用蔗糖。本研究从酿酒酵母基因组中克隆得到蔗糖酶基因SUC2。将SUC2亚克隆后得到表达载体pPICZαA-SUC2。经电转化后,表达载体整合进入毕赤酵母KM71H基因组,得到能够利用蔗糖的毕赤酵母工程菌。     

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。     

基因拷贝数对重组毕赤酵母的牛乳铁蛋白功能片段表达及细胞存活率的影响

为了提高牛乳铁蛋白功能片段(bovine lactoferrin functional fragment,BlfFf)产量,研究了基因拷贝数对重组毕赤酵母蛋白表达及酵母存活率的影响。将未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR)激活因子基因HAC1、信号肽切割酶基因Kex2导入重组毕赤酵母BlfFf G01,并以核糖体r DNA非转录基因间隔区同源整合的方法结合PTVA(posttransformational vector amplification)法扩增重组菌株的基因拷贝数。利用SDS-PAGE、Western Blot、ELISA及流式细胞术分析多拷贝重组菌株发酵产物。分析表明,重组蛋白产量随着BlfFf基因拷贝数的增加而增加,但并非线性递增。HAC1拷贝数为3的BlfFf G12菌株产量相比单拷贝的BlfFf G10提高了150%,但更高的HAC1基因拷贝数降低了重组蛋白产量。流式细胞术分析显示,发酵末细胞存活率随着重组菌株中BlfFf基因拷贝数增加而下降,而HAC1基因拷贝数增加可一定程度上提高细胞存活率。摇瓶中BlfFf产量最高的BlfFf...     

RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因（SacB）的拷贝数及信使核糖核酸（mRNA）转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平（2.13）为单拷贝菌株（0.42）的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活（13.96 U/mL）较单拷贝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加（P＜0.05）,说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。     

中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

有机磷污染是食品安全的重大隐患,乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,ACh E)可用于有机磷农药残留的检测。中华蜜蜂是我国独有的蜜蜂当家品种,蜜蜂对农药的敏感性很高,中华蜜蜂来源的乙酰胆碱酯酶基因尚未被克隆并应用于食品安全监测。以中华蜜蜂头部组织总RNA为模板,经RACE方法获得了ACh E基因c DNA全序列,全长约1.8 kb。构建重组表达载体p PIC3.5K-ACh E,将目的基因表达盒整合入毕赤酵母GS115的基因组中获得重组菌株,0.5%甲醇诱导重组菌株表达ACh E蛋白,经SDS-PAGE、酶活性分析表明,中华蜜蜂ACh E基因首次克隆成功并首次在毕赤酵母中获得成功表达,筛选出一株酶活性较高的菌株,纯化的重组乙酰胆碱酯酶其活性为10 568 U/mg,可以用于有机磷农药残留的检测。     

代谢工程改造毕赤酵母生产葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是一种具有重要生物功能的有机酸,为了实现微生物合成葡萄糖二酸的高效生产,异源表达来源于小鼠基因组的MIOX基因及Pseudomonas putida KT2440的udh基因,在毕赤酵母中构建葡萄糖二酸合成途径,实现了葡萄糖二酸的生成。通过在摇瓶水平进行优化,确定了最适碳源为葡萄糖(初始质量浓度60 g/L最优),最适初始pH为5.5,最优接种龄为24 h,最适接种体积分数为25%,重组毕赤酵母生成的葡萄糖二酸产量从最初的(566.36±16.98) mg/L提高至(967.60±3.90) mg/L。在此基础上,重组毕赤酵母在3 L发酵罐中放大培养,葡萄糖二酸的产量达到了(2.60±0.04) g/L。     

在酿酒酵母中共表达sXYLA和XKS1及木糖发酵的初步研究

为改善重组酵母发酵木糖生产乙醇的能力,将定点突变改造后的Thermus thermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酸酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499进行表达研究。酶活检测表明,改造后的木糖异构酶活性是未改造的1.91倍。在此基础上将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXYLA和来自酸酒酵母的木酮糖激酶基因XKS1耦联,构楚得到重组表达质粒pYX-sXYLA- XKS1,在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达。结果表明,在84 h时重组菌发酵液酶活达到最高,木糖异构酶为0.624 U/mg蛋白,木酮糖激酶为0.688 U/mg蛋白。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵,代谢产物分析表明酸酒酵母重组菌木糖的消耗为4.75 g/L,乙醇的产量为0.839 g/L,分别比出发菌提高20.9%和14.8%,为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定基础。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。     

重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒 2 型（PCV2）是引起断奶猪多系统衰竭综合症（PMWS）的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白（PCV2-Cap）是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前 PCV2 疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究 PCV2-Cap 蛋白的重组表达及疫苗活性,将 PCV2-Cap 基因序列去除核定位信号序列（NLS）后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌 X-33,经 Zeocin 抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和 Western blot 结果显示 Cap 蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为 26 ku。5 L 罐高密度发酵小试,得到 PCV2-Cap 蛋白在发酵上清液中的浓度约为 0.53 mg/m L,占总蛋白的 23.5%。动物免疫试验显示重组 Cap 蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap 基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为 PCV2-Cap 毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。     

响应面法优化弗托氏葡糖酸杆菌产羟基乙酸工艺条件

为了构建一株可以生产乙醇酸的食品安全菌株,对枯草芽孢杆菌开展了代谢改造。本研究首先利用同源重组手段将外源异柠檬酸裂解酶基因aceA整合到了枯草芽孢杆菌基因组上,构建了出发菌株164MCT-GA,然后利用代谢工程手段进行了乙醇酸合成代谢优化。结果表明,整合外源异柠檬酸裂解酶基因aceA的出发菌株164MCT-GA可以实现以甘油为底物的乙醇酸从头合成,摇瓶发酵产量为0.114 g/L;在此基础上,过表达柠檬酸合成酶基因（citA）,加强前体物供应;过表达乙醛酸还原酶基因（yvcT）、敲除乳酸脱氢酶基因（ldh）、磷酸乙酰转移酶基因（pta）、乙酰-CoA转乙酰酶基因（mmgA、yhfs）,从而减少碳源损失并提高乙醇酸转化率,最终得到的工程菌GA3-52,其摇瓶发酵产量为0.572 g/L,是出发菌株的5倍以上,产率为0.175 g/g甘油,本研究首次在枯草芽孢杆菌中利用乙醛酸循环进行乙醇酸的从头合成,为食品安全菌高产乙醇酸的发酵生产奠定了基础。     

cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。     

高产β-葡萄糖苷酶工程菌株的构建及其在2,6-二甲氧基对苯醌发酵制备中的应用

构建高产β-葡萄糖苷酶的工程菌株并将其应用到2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中。通过聚合酶链式反应从酿酒酵母CS1401的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因,并与载体p PICZαA连接后导入毕赤酵母X33中进行甲醇诱导表达;对表达成功的重组菌株进行β-葡萄糖苷酶活力测定;同时将酿酒酵母CS1401和重组菌株接种到小麦胚芽培养基中进行发酵并测定2,6-二甲氧基对苯醌的发酵产量。结果表明,酿酒酵母CS1401的β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母X33工程菌株中得到高效表达,酶活力达到4.5 U/m L,为酿酒酵母CS1401的5倍;2,6-二甲氧基对苯醌的摇瓶发酵产量达到935.7 μg/g,比酿酒酵母CS1401提高了0.4倍。因此,高产β-葡萄糖苷酶的重组工程菌株在2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中具有一定的应用前景。     

Cloning and Expression of AROIO Gene in Saccharomyces cerevisiae and It＇ s Influence on 3- （methylthio） -1-propanol Biosynthetic Metabolism

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒（载体）pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶（EC 4.1.1.72）是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

脲基酰胺酶基因在黄酒酵母中的整合型表达

氨基甲酸乙酯是一种人类的潜在致癌物,在许多发酵酒中均有存在,主要来源于发酵过程中酵母代谢产生的尿素。以pYX212为载体,将脲基酰胺酶基因DUR1,2克隆到TPI强启动子和终止子之间的位点,再通过同源重组的方式将受强启动子调控的目的基因整合到黄酒酵母的基因组中,最终获得一株低产尿素的胞内脲基酰胺酶基因组成型高表达的黄酒酵母85#DUR1,2。在实验室规模的黄酒酿造实验中,85#DUR1,2产尿素量为8.34mg/L,比出发菌株降低了69.9%,贮存一段时间后的酒液中氨基甲酸乙酯含量比出发菌株降低了40.5%,而发酵性能、酒精度、总酸及氨基态氮与出发菌株无显著差异。