过表达pls基因结合前体流加提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸产量

为了提高小白链霉菌(Streptomyces albulus)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)发酵产量,以进一步降低其生产成本,该研究通过过表达ε-PL合成酶基因pls增强S. albulus合成ε-PL能力,并结合前体和能量辅因子流加强化其发酵过程。研究结果显示,过表达菌株S. albulus M-Z18/p IB139-pls的pls基因转录上调了16. 8倍,摇瓶ε-PL产量达到(2. 74±0. 23) g/L,5 L发酵罐ε-PL产量达到40. 62 g/L(144 h)。为进一步满足过表达菌株合成ε-PL过程中对前体和能量辅因子的需求,通过优化L-赖氨酸和ATP外源添加浓度,最终建立S. albulus M-Z18/p IB139-pls在5 L发酵罐中同时流加5. 0 g/L的L-赖氨酸和1. 0 mmol/L ATP的补料分批发酵方式,实现ε-PL产量达到45. 09 g/L(144 h),较对照菌株S. albulus M-Z18/p IB139提高了20. 8%。因此,采用过表达pls基因并结合补充前体L-赖氨酸和能量辅因子ATP是一种有效...     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...     

pH值和比生长速率协同调控Streptomyces albulus合成ε-聚赖氨酸

聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是Streptomyces albulus分泌产生的1种抗菌肽,主要用作生物食品防腐剂。为了进一步了解S. albulus积累ε-PL的影响因素,该文探究了恒化培养体系下不同pH值和菌体比生长速率对S. albulus M-Z18合成ε-PL的影响。结果发现,随着pH降低(D=0. 04 h~(-1)),细胞得率(Y_(X/S))逐渐减小,葡萄糖比消耗速率(q_S)、ε-PL比合成速率(q_P)和胞内ATP浓度逐渐增加。与此相一致,随着菌体比生长速率增加(pH 4. 0),q_S、q_P和胞内ATP浓度均呈逐渐增加趋势。因此,低pH和高菌体比生长速率都有助于S. albulus M-Z18高效积累ε-PL。该研究一方面为S. albulus在低pH环境积累ε-PL的原因提供了新的认识,另一方面也为后续通过提高细胞比生长速率而增加ε-PL产量的发酵优化提供了理论指导。     

链霉素抗性选育ε-聚赖氨酸高产菌株

基于核糖体工程的育种方法,通过逐级赋予小白链霉菌M-Z18链霉素抗性,以提高产生菌的ε-聚赖氨酸(ε-PL)合成能力。首先,通过筛选低浓度链霉素(1~5 MIC)抗性突变株,将M-Z18的ε-PL的摇瓶产量从1.6提高到2.43 g/L;随后,再次提升菌株的链霉素耐受性(5~10MIC),进一步增强菌株的ε-PL合成能力;最后,获得一株高产突变菌SS-19,其ε-PL产量和单位菌体合成能力分别为3.13 g/L和0.58 g/g,较出发菌M-Z18分别提高了95.63%和137.61%。研究表明,SS-19的中心碳代谢途径及ε-PL合成相关的关键酶活性有所增加,意味着ε-PL的合成代谢被明显加强。在以葡萄糖为碳源的RSM培养基中,SS-19比前期育种获得的高产菌株表现出更好的ε-PL合成能力。以上结果表明,通过逐步引入高浓度链霉素抗性的筛选方法可有效提升小白链霉菌的ε-PL产量。     

pH-DO组合调控策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂，具有广泛的工业应用价值。该研究对ε-PL高产菌Streptomyces albulus WG-608在5 L罐发酵不同阶段的pH与溶解氧(dissolved oxygen, DO)进行了系统优化，并构建了一种新的pH-DO组合调控策略。该策略将发酵分为2个阶段：第一阶段DO被控制在40%,pH维持在4.0;第二阶段DO被控制在20%,pH维持在4.3。经240 h的补料-分批发酵，WG-608的ε-PL产量与平均比生产速率为(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d^-1,比对照策略分别提高了28.23%和12.02%。为进一步探究该策略提高WG-608 ε-PL产量的细胞生理代谢差异的原因，对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明，葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是pH-DO组合调控策略增强ε-PL产量的原因。总之，pH-DO组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能...     

ARTP-DES连续诱变选育高产ε-聚赖氨酸突变株

为提升小白链霉菌(Streptomyces albluus)产ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)能力,在常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)、硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)单因子诱变的基础上,采用ARTP-DES连续诱变。连续诱变条件:ARTP工作功率110 W,照射距离2 mm,照射时间为30、60、105 s;DES诱变体积分数0.6%,反应时间20 min。并改进一种快速筛选方法,结合链霉素抗性、亚甲基蓝透明圈及48微孔板培养,酶标仪快速测定ε-PL含量。结果表明:ARTP-DES连续诱变结合链霉素抗性正突变率可达40.8%,同时,获得1株遗传性能稳定的链霉素抗性突变株S. albulus AD-9,其ε-PL摇瓶产量为2.1 g/L,是出发菌株的2.1倍。通过研究高产菌株的生理特性,发现其在营养需求、发酵过程中菌球形态等都发生了变化。ARTP-DES连续诱变选育高产ε-PL菌株是一种高效选育手段。     

中间代谢产物对白色链霉菌ε-聚赖氨酸合成的影响

探讨白色链霉菌ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)生物合成过程中,中间代谢产物柠檬酸、L-天冬氨酸和L-赖氨酸对ε-PL合成的影响。单因素实验结果表明,在摇瓶发酵开始(0 h)添加柠檬酸至终质量浓度为1.0g/L,培养到12 h分别添加终质量浓度为0.3 g/L的L-天冬氨酸和终质量浓度为1.0 g/L的L-赖氨酸,可分别提高ε-PL产量42.5%、28.7%和44.1%。正交试验显示,只有柠檬酸和L-赖氨酸对ε-PL合成影响显著(P0.05),而L-天冬氨酸影响不显著;在培养基中添加1.0 g/L的柠檬酸和L-赖氨酸ε-PL产量可提高60.1%。在破碎的无细胞体系中,只有添加L-赖氨酸可以检测到ε-PL的生成,进一步证实了L-赖氨酸是ε-PL合成的直接前体。因此,通过添加合适的中间代谢产物,可以有效提高ε-PL产量。     

ε-聚赖氨酸发酵工艺的研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由白色链霉菌产生的一种新型天然聚合物,由25～35个L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基连接形成。现代生物技术基因工程、基因组重排和响应面法已经在工业规模上显著提高了这种新型同源多聚氨基酸的合成效率,并扩展了其工业应用。ε-PL已被广泛用作食品和化妆品行业的防腐剂,生物可降解材料,基因转运载体等。近年来的研究主要集中在微生物技术生产ε-PL和生物合成机理方面。文章着重介绍了ε-PL发酵工艺的研究进展,包括培养基的优化、p H控制策略、溶解氧控制策略、生物反应器和其他生产工艺;概述了ε-PL生物合成和产ε-PL菌株分离改造。这将有助于这种新型聚合氨基酸的发展,同时为其他生物聚合物的研究提供参考。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量（英文）

为提高灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus LS-6)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine,ε-PL)发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum S62)进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力(己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等)和胞内氨基酸含量(赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等)均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

优化有机氮源提高小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸效率

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)分泌产生的一种同型氨基酸聚合物,具有广泛的抑菌活性,目前被多个国家批准使用,是一种优良天然食品防腐剂。为了进一步提高S. albulus GS114的ε-PL发酵产量,对其发酵培养基中有机氮源的种类及浓度进行了系统优化,并对ε-PL产量提高的原因从氨基酸方面进行了初步解析。研究结果显示,S. albulus GS114的最佳有机氮源为酵母浸粉FM760,最佳添加质量浓度为9.27 g/L,在此条件下,摇瓶自然发酵中ε-PL产量达到(2.60±0.02) g/L,较对照有机氮源提高了22.07%;在pH受控的分批发酵中,ε-PL产量达到(6.41±0.23) g/L,较对照提高42.64%;在补料分批发酵中,ε-PL产量达到62.38 g/L,较对照提高了18.80%,葡萄糖转化率提高了25.77%。同时,通过氨基酸添加实验,初步发现酵母浸粉FM760提高ε-PL产量可能与异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸有关。该研究结果对工业发酵生产ε-PL的有机氮源选择具有重要指导意义。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造（英文）

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C.glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C.glutamicum YILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量(分别从1.32μmol/g(细胞干质量,下同)和5.18 g/L提高至3.32μmol/g和5.81 g/L),但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilv BNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brn E和brn F,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C.glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilv BNC操纵子及brn E和brn F能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量

为提高灰褐链霉菌（Streptomyces griseofuscus LS-6）的ε-聚赖氨酸（ε-poly-lysine,ε-PL）发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum S62）进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1 株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73 倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力（己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等）和胞内氨基酸含量（赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等）均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸工艺优化

为建立Streptomyces albulus M-Z18以葡萄糖为碳源的ε-聚赖氨酸(ε-PL)高效发酵工艺,对葡萄糖和硫酸铵的流加方式和控制浓度、pH控制条件和溶氧控制水平进行了系统研究。研究结果表明,葡萄糖补料采用脉冲补料方式控制维持在10~30 g/L范围,氨氮补料采用脉冲补料方式维持在0.1~0.5 g/L范围,pH冲击时间为9 h、恢复pH为3.85,发酵中后期最佳溶氧水平为20%左右为最优ε-PL发酵工艺控制条件。经过8天补料-分批发酵,实现ε-PL产量达到47.13 g/L,菌体量为57.08 g/L,相比于优化前,ε-PL产量和菌体量分别提高了27.34%和19.61%。上述研究结果为ε-PL工业化生产奠定了基础。     

ε-聚赖氨酸高产菌株的诱变选育

ε-聚赖氨酸(ε - PL)是一种L- lysine同聚物,主要由链霉菌科和麦角真菌产生.但是,ε-PL野生菌株的生产能力较低,这一定程度上制约对它的进一步研究和利用.对于包括链霉菌在内的大多数细菌,ε- PL的前体物lysine一般是通过天冬氨酸途径合成的.这条途径中的第一个关键酶Ask活性会受到氨基酸终产物的调节.而且,天冬氨酸还可以反馈抑制上游磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶的活性.为了解除上述反馈调节,提高ε - PL产生菌的产量,我们利用(SG+ Gly+L- lysine+ AHV)复合抗性,筛选出一种高产菌株L9.最终,我们得到了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)L9,其摇瓶产量为0.69g/L,比出发菌株高13％.经代传稳定性研究证明其产酸量和抗性标记均可稳定遗传.     

白色链霉菌ε-聚赖氨酸合酶的异源表达及重组菌全细胞合成ε-聚赖氨酸的条件优化

聚赖氨酸是一种典型的同型L-赖氨酸聚合物,具有广谱抗菌活性和抗噬菌体活性,广泛应用于食品和医药行业。该文克隆了经密码子优化的白色链霉菌Streptomyces albulus来源的ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls,首次实现了其在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中的异源表达。其次,对B.subtilis 168/p MA5-pls重组菌株生产ε-聚赖氨酸的全细胞催化体系进行了优化,结果表明,在L-赖氨酸质量浓度0.5 g/L,初始pH和温度分别为3.0和30℃条件下,ε-聚赖氨酸合酶的转化效果最好。在最优体系条件下,连续转化4 h,ε-聚赖氨酸的产量达到195.1 mg/L,高于已报道的Bacillus subtilis直接发酵生产的ε-聚赖氨酸产量。该研究构建的全细胞催化体系为食品级ε-聚赖氨酸的生产提供了新策略。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C. glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C. glutamicumYILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量（分别从1.32 μmol/g（细胞干质量,下同）和5.18 g/L提高至3.32 μmol/g和5.81 g/L）,但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilvBNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brnE和brnF,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C. glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilvBNC操纵子及brnE和brnF能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

辅助能量物质柠檬酸促进ε-聚赖氨酸的合成

为提高ε-聚赖氨酸(ε-PL)合成能力,考察了柠檬酸对Streptomyces sp.M-Z18菌体生长和ε-PL合成的影响。研究发现,柠檬酸作为辅助能量物质,对ε-PL发酵过程影响显著。通过对柠檬酸添加时间、添加量和pH值的优化,确定了最佳柠檬酸添加方式,结合补料-分批发酵工艺,显著提高了ε-PL的产量。实验结果表明,在5L发酵罐中,维持pH为3.8,初始柠檬酸添加量为20 g/L时,分批发酵ε-PL的产量达到9.50 g/L,产率达到4.40 g/(L.d),较未添加柠檬酸发酵分别提高了46.4%和48.1%。采用添加柠檬酸的补料-分批发酵工艺,发酵168 h后ε-PL的产量达到22.89 g/L,是分批发酵的2.41倍。     

氮离子入法筛选ε-聚赖氨酸高产菌株

研究氮离子注入法诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株.本文从土壤筛选的菌株TS02出发,通过注入不同剂量30 keV氮离子,辅以抗性平板法结合抑菌圈法,筛选出了一株ε-聚赖氨酸高产白色链霉菌(Streptomyces albulus)GC11.经多次传代实验结果表明GC11稳定性良好.摇瓶发酵培养24h,GC11抑菌圈直径为23.20mm,比TS02提高了1.32倍;5L自控发酵罐发酵培养72h,GC11ε-PL产量为4.21 g/L,比TS02提高了1.30倍,达到了提高ε-聚赖氨酸产量的目的.     

采用超滤法纯化ε-聚赖氨酸

采用超滤技术从ε-聚赖氨酸(ε-PL)粗品溶液中纯化ε-PL,研究了超滤过程中的操作压力、操作温度、超滤液的体积和料液初始浓度等因素对膜通量和粗品溶液中蛋白截留率及ε-PL透过率的影响;并确立了采用聚砜膜去除ε-PL粗品溶液中蛋白工艺的最佳参数,在此条件下,蛋白去除率达到86.2%,ε-PL透过率达到86.7%.