耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸合酶基因的差异

目的:研究筛选得到的野生耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因(cfa)的差异,探索酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因与酒酒球菌耐酸性的相关性。方法:35株野生酒酒球菌中,利用酸胁迫环境筛选耐酸能力最强的菌株,并与野生酸敏菌SX-1b及实验室离子注入诱变的耐酸、酸敏突变菌a3、b2共同进行环丙烷脂肪酸基因cfa的克隆、测序和比对;选择存在氨基酸突变的野生耐酸酒酒球菌及野生酸敏菌株的cfa基因在植物乳杆菌ATCC33222中进行外源表达,从而验证耐酸菌株cfa基因与耐酸能力的相关性。结果:(1)筛选出野生型耐酸酒酒球菌CS-7b和ME-5b,确定其耐酸生长极限为p H 2.6;(2)对野生菌与诱变菌的cfa基因进行测序比对发现,耐酸菌株的野生型和诱变型的序列相同,较酒酒球菌PSU-1发生3处碱基突变,而酸敏菌野生型、诱变型的序列则与酒酒球菌PSU-1一致;(3)将SX-1b与CS-7b的cfa基因在植物乳杆菌中表达,构建重组载体pMG36ecfa1和pMG36e-cfa2,并得到对应重组菌L1和L2;(4)在pH 3.6培养基中培养,重组菌L1和L2的生长情况明显优于含空载体的植物乳杆菌L0,且L2的生长优于L1。而在p H 3.4培养基中培养,L0没有生长迹象,只有重组菌L1和L2正常生长,cfa基因的导入突破了植物乳杆菌宿主菌的生长极限。结论:酒酒球菌cfa基因及基因间存在的稳定差异与菌株耐酸表型具有一定相关性。     

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与耐酸胁迫能力的相关性分析

目的:β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中结合态香气物质释放的关键酶,但其活性受诸多因素的影响。本研究旨在从酒酒球菌自身耐酸能力的视角去分析评估菌株糖苷酶活性,探索酸胁迫下不同耐酸表型酒酒球菌与其β-葡萄糖苷酶活性之间存在的相关性关系。方法:结合利用离子注入诱变与胁迫环境筛选的方式,获得耐酸(p H 3.0)、酸敏(p H 9.0)突变酒酒球菌菌株,对其β-葡萄糖苷酶的活力进行测定,并筛选3组酸胁迫下表型差异大的β-葡萄糖苷酶基因送样测序。结果:耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出发菌株的2~4倍,是相应酸敏突变株的2~7倍。测序结果显示,除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位(G置换成C)和1 232(A置换成T)位处发生了突变外,其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未发生改变。结论:酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与菌株酸胁迫能力显著相关(P0.05)。耐酸胁迫能力越强的菌株,β-葡萄糖苷酶活性越高。     

酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变株苹果酸-乳酸发酵能力分析

目的：研究酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变菌株的抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力,为耐酸突变菌株开发为商业发酵剂提供参考。方法：以采用离子注入诱变,分离纯化后筛选出耐酸突变菌株b1为研究对象,酒酒球菌SX-1b和商业菌株31-DH为对照,探究单因素胁迫环境、复合因素胁迫条件及模拟酒环境对菌株b1生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响,评价菌株b1的苹果酸-乳酸发酵能力。结果：单因素试验结果显示,当pH?3.0、乙醇体积分数14%、L-苹果酸质量浓度3?g/L时,菌株b1的L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株;正交试验进一步确定各因素对菌株生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响程度为：pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸质量浓度;当模拟酒的乙醇体积分数为14%时,菌株b1的累积L-苹果酸降解量为1.493?2?g/L,分别为SX-1b与31-DH的1.41?倍和1.26?倍,且菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性最高。结论：耐酸突变菌株b1表现出良好抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力。因此,菌株?b1具有成为商业发酵剂的潜能。     

基于RNA-seq分析酒酒球菌SD-2a酸胁迫应答机制

通过RNA-seq检测酒酒球菌SD-2a对短期酸胁迫（3 h）的反应,利用基因本体论和京都基因与基因组百科全书数据库分析不同处理间的转录组数据。此外,还测定了一些与应激反应相关的生理指标。在此基础上,绘制胁迫响应机理示意图。在酸性胁迫条件下,菌株合成更多的ATP,将H＋泵出细胞,SD-2a的ATPase活性显著升高,适宜pH值可以维持适宜的酶反应环境进行生命活动。通过调节总不饱和脂肪酸和总环脂肪酸的含量,降低细胞膜的流动性。综上所述,胞内能量生产显著增加,一些有利于抗酸胁迫的耗能反应显著增加,而一些不相关的耗能反应受到抑制。此外,为了应对酸胁迫造成的损伤,DNA修复基因和伴侣蛋白基因的表达水平大大提高。本研究结果为酒酒球菌中与酸应激反应相关的调控网络提供了一定参考。     

酒酒球菌胁迫适应性机制的研究进展

酒酒球菌是使苹果酸乳酸发酵(MLF)能够顺利进行的重要启动者,也是耐受性最强的乳酸菌。概述了酒体温度、乙醇浓度和pH值对酒酒球菌的影响及菌体的胁迫适应性机制的研究进展,并提出目前研究存在的问题及展望。这对更好的了解酒酒球菌的特性具有重要意义。     

酒酒球菌基因功能研究方法进展

酒酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)的主要启动者与承担者,在葡萄酒酿造工业中具有重要地位。葡萄酒生境中的高酸度、高酒精度、低温等胁迫环境的存在,使得MLF的启动常常发生延迟甚至失败,因此,需要明确在酒酒球菌中发挥胁迫应答功能的关键基因及其作用机制。研究者利用组学技术发掘出大量与酒酒球菌特定表型或功能相关的基因,但相关研究进展缓慢,亟需确证这些基因与表型或功能的确切关系及其作用机制,为代谢调控或定向菌种改造增加MLF启动稳定性提供理论与技术支撑。文章归纳了组学技术和基因工程技术在酒酒球菌和植物乳杆菌中的应用进展,以期让研究者更加关注基因工程技术在酒酒球菌基因功能及其他相关的研究中,解决酒酒球菌基因功能研究的难题。     

紫外诱变法选育酒酒球菌乙醇胁迫耐受菌株及其发酵性能研究

该研究以酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a为研究对象,采用紫外诱变法选育乙醇胁迫耐受突变菌株,评价其在乙醇胁迫条件下的生长能力,并测定其产β-葡萄糖苷酶活性及其在模拟酒中苹果酸、乳酸含量及活菌数的变化。结果表明,分离筛选到3株乙醇胁迫耐受性好的突变菌株,分别编号为UVe1、UVe2、UVe3,在高体积分数乙醇（12%和14%）胁迫环境下,3株突变菌株的生长速度均显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）;突变菌株UVe2的β-葡萄糖苷酶活性显著高于出发菌株SD-2a和对照菌株L-450（P＜0.05）;在模拟酒中,3株突变菌株的苹果酸降解与乳酸生成速度均显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）,且突变菌株UVe1和UVe2的存活率显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）;综上,突变菌株UVe2具有优良商业酒酒球菌的潜力。     

酸胁迫条件对粪肠球菌Gr17代谢合成细菌素的影响

目的:粪肠球菌Gr17分离自中国传统发酵酸鱼,可以代谢合成新型广谱IIa类细菌素enterocin Gr17,有作为发酵食品功能性菌株的巨大应用潜力,然而该菌株应用于实际发酵环境时会面临各种胁迫条件,酸胁迫是其中主要的胁迫因素之一。本研究旨在探讨不同酸胁迫条件对菌株Gr17生长及代谢合成细菌素的影响。方法:在筛选可正向影响细菌素合成的酸胁迫条件参数基础上,测定该条件下细菌素生物合成相关基因的表达水平变化,分析其影响机制。结果:与正常生长条件pH 7.0相比,在pH 4.5~6.5的酸胁迫条件下,菌株Gr17的菌体密度会随pH值的下降而降低;pH 5.0～6.5的酸胁迫条件可明显正向提高细菌素的分泌合成量,其中pH 5.5的酸胁迫条件最为明显。在此条件下,细菌素生物合成相关ABC转运系统as-48H、as-48G、as-48F、as-48E基因表达在处理时间48 h内没有显著变化,种内群体感应调控系统自诱导肽基因entIP在8 h时表达量明显提高,双组分基因entPK、entR以及细菌素编码基因entGr17在12 h时表达量明显提高。结论:基于以上结果,推测pH 5.5的酸胁迫条件可以促进自诱导肽的分泌表达,正向调控种内群体感应系统,从而增加细菌素的合成。本研究结果对于从分子水平上全面揭示实际发酵环境中乳酸菌细菌素的合成调控行为,最大限度地提高产细菌素乳酸菌在发酵生产中的应用价值具有重要的科学和现实意义。     

酸胁迫对干酪乳杆菌细胞膜生理特性的影响

以干酪乳杆菌为研究对象,考察了酸胁迫对细胞膜生理特性的影响。研究结果表明,随着pH的降低,细胞膜侧向扩散系数降低,微黏度增加。同时分析细胞内膜透性和胞内金属离子浓度表明酸胁迫引起细胞膜透性增加。分析膜脂肪酸成分结果表明,酸胁迫引起不饱和脂肪酸含量增加,饱和脂肪酸含量降低,同时细胞膜脂肪酸不饱和度和膜脂碳链长度也相应增加。研究结果将为进一步解析干酪乳杆菌酸胁迫抗性机制奠定理论基础。     

干酪乳杆菌Zhang在不同温度下的膜脂肪酸变化分析

探究了干酪乳杆菌Zhang在不同温度下细胞膜脂肪酸变化。将干酪乳杆菌Zhang在MRS培养基中培养的对数生长末期菌体分别置于37、45、60、70℃4种温度水浴锅中进行热处理,不同时间点取样,采用Bligh&Dyer法提取脂肪酸后通过气相色谱仪测定其组分,并分析含量变化。结果显示,干酪乳杆菌Zhang在不同温度处理下,主要有5种脂肪酸发生了变化;从相对百分含量上看,细胞中不饱和脂肪酸增加,饱和脂肪酸减少。推测干酪乳杆菌Zhang通过调节脂肪酸的组分和含量改变细胞膜流动性来维持其生存能力,这为初步解析干酪乳杆菌Zhang逆境生存机理提供了数据参考。     

乳酸乳球菌硫胺素转运蛋白ThiT提高酸耐受性的机制

碳代谢引起的酸积累严重影响了微生物细胞的代谢活性。为提高细胞在酸性环境下的耐受性,通过过量表达硫胺素转运蛋白ThiT,研究了重组菌株的酸胁迫耐受性,并在此基础上通过比较转录组学对照菌株和重组菌株在正常和酸胁迫条件下关键基因的转录水平进行了研究。结果表明,经过酸胁迫（pH 4.0） 处理后,重组菌株的最大存活率优势是对照菌株的16.2倍。转录组学的分析发现,过表达ThiT转运蛋白可提高细胞对碳水化合物的转运能力,从而为细胞抵御酸胁迫的耐受性提供更多的能量;此外寡肽、甜菜碱等相关转运基因的显著上调可帮助细胞抵御酸胁迫的损伤。作者探究了在乳酸乳球菌中过表达ThiT转运蛋白提高细胞酸胁迫耐受性的具体作用机制,为ThiT蛋白在其他工业微生物中的应用提供了理论基础。     

过量表达purC基因对Lactococcus lactis NZ9000酸胁迫抗性的影响

通过在乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000中过量表达嘌呤代谢途径中编码磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合酶的pur C基因,测定了重组菌株在酸胁迫条件下的存活率,经p H 4. 0胁迫培养4 h后,重组菌株的存活率为对照菌株的83. 2倍。采用ATP测定试剂盒和高效液相色谱分别考察菌株胞内ATP和氨基酸含量。结果表明,重组菌株在酸胁迫条件下维持了更高的胞内ATP和氨基酸(天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸)含量,分别通过为细胞提供能量和消耗胞内质子的方式,帮助乳酸乳球菌抵御酸胁迫。研究发现,在乳酸乳球菌中过表达pur C基因能够明显提高菌株的酸胁迫抗性,同时为进一步通过改造嘌呤代谢途径提高乳酸菌酸胁迫耐受性提供了新的思路。     

酸、热胁迫条件下酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因的表达分析

本研究在克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T SOD基因全序列的基础上,利用荧光实时定量PCR技术分别检测酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因在酸、热胁迫条件下的表达差异。结果表明:该基因在正常生长条件下组成性表达,在酸、热胁迫下表达量在短时间内迅速上调,酸胁迫0.5 h表达量为对照组的4.63倍,胁迫1 h表达量升至最高,为对照组的32.55倍,随后表达量迅速下调,胁迫5 h时表达量降至对照组的1.67倍。70℃热胁迫5 min时SOD基因相对表达量为对照组的2.81倍,胁迫25 min时表达量升至最高,为对照组的15.05倍,随后表达量下调,胁迫40 min时表达量降至对照组的4.93倍。酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因对酸、热环境胁迫具有快速反应的特点,表明酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因与该菌嗜热耐酸的独特生理适应机制密切相关。     

多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率及细胞成分的影响

本研究以嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792)为实验菌株,考察了单因素(酸、热、盐)胁迫和交互保护对其存活的影响。结果表明,T.halophilus CGMCC 3792在p H4.0和45℃预适应处理60 min后细胞对酸致死胁迫(p H2.5,60 min)的存活率分别提高了10.6倍和8.8倍。此外,还考察了酸胁迫对细胞膜不饱和脂肪酸和胞内氨基酸含量的影响,结果表明,酸预适应后再经酸致死胁迫导致细胞膜不饱和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分别是直接经酸致死胁迫的2.3倍和2.0倍;同时,分析胞内氨基酸含量,胞内谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度分别是直接经酸致死胁迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究结果将有助于进一步解析嗜盐四联球菌环境胁迫抗性的生理机制。     

异源表达酸土脂环酸芽孢杆菌DnaJ基因提高大肠杆菌胁迫抗性

构建重组质粒p ET28a-Dna J,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组大肠杆菌表达酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J,对重组大肠杆菌和对照大肠杆菌分别进行热及酸、碱胁迫处理,研究酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J基因异源表达对重组大肠杆菌胁迫抗性的影响。试验结果表明,经过热、酸胁迫后,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株,而在碱胁迫条件下,两种菌株的存活率相差不大,说明酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J基因在大肠杆菌中异源表达能显著提高宿主菌对高温及酸胁迫的抗性,为发酵工业生产中构建高产抗逆工程菌株提供基因素材和理论依据。     

多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率及细胞成分的影响

本研究以嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792）为实验菌株,考察了单因素（酸、热、盐）胁迫和交互保护对其存活的影响。结果表明,T.halophilus CGMCC 3792在p H4.0和45℃预适应处理60 min后细胞对酸致死胁迫（p H2.5,60 min）的存活率分别提高了10.6倍和8.8倍。此外,还考察了酸胁迫对细胞膜不饱和脂肪酸和胞内氨基酸含量的影响,结果表明,酸预适应后再经酸致死胁迫导致细胞膜不饱和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分别是直接经酸致死胁迫的2.3倍和2.0倍;同时,分析胞内氨基酸含量,胞内谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度分别是直接经酸致死胁迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究结果将有助于进一步解析嗜盐四联球菌环境胁迫抗性的生理机制。      

不同胁迫温度条件下坛紫菜中脂肪酸和挥发性物质分析

为了解高温胁迫条件下坛紫菜脂肪酸变化规律,采用气相色谱-质谱联用技术对不同胁迫温度条件下的坛紫菜脂肪酸和挥发性物质进行分析。结果显示,以20℃为对照温度,分别在25、28℃和35℃三个温度胁迫后,坛紫菜中共鉴定出13种总脂肪酸、14种游离脂肪酸和32种挥发性物质。当胁迫温度升高至28℃时,饱和脂肪酸和挥发性物质含量随胁迫温度升高而增加,而不饱和脂肪酸和游离脂肪酸含量则随胁迫温度升高而降低;当胁迫温度升高至35℃时,总脂肪酸、总游离不饱和脂肪酸和挥发性物质含量均随胁迫温度升高而降低。了解高温胁迫条件下总脂肪酸、游离脂肪酸和挥发性物质之间的转化,有助于了解坛紫菜抗高温胁迫机理和坛紫菜的健康栽培。     

基于转录组学分析酸胁迫影响鼠伤寒沙门氏菌耐酸能力的机理

目的：探究酸胁迫和非酸胁迫条件下鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的转录组反应,分析差异基因（differentially expressed genes,DEGs）表达水平,阐明酸胁迫影响鼠伤寒沙门氏菌耐酸反应（acid tolerance response,ATR）的相关代谢通路。方法：对鼠伤寒沙门氏菌进行酸胁迫处理,利用转录组测序技术和生物信息学分析相关DEGs,并通过实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）进行验证。结果：经酸胁迫后,共筛选到683 个DEGs,其中上调343 个,下调340 个。其中涉及细胞运动、氨基酸代谢、细胞膜组成等通路上调能够使鼠伤寒沙门氏菌快速适应酸环境;碳水化合物代谢相关通路上调能够为鼠伤寒沙门氏菌快速适应酸环境提供更多的能量,与此同时,嘧啶代谢等能量代谢通路下调能够使鼠伤寒沙门氏菌降低能量消耗以维持上述的必需代谢过程;细菌应激调控相关通路上调赋予鼠伤寒沙门氏菌交叉保护抗性;鞭毛、外膜蛋白、脂多糖等毒力相关基因表达上调增强了鼠伤寒沙门氏菌的毒力。real-time PCR验证结果与转录组测序分析表达趋势一致。结论：酸胁迫显著提高了鼠伤寒沙门氏菌的耐酸能力,其中与代谢和细胞过程相关的通路发挥主要作用,本研究结果为进一步了解该菌的酸胁迫反应及更好地控制其在食品中的污染提供了理论依据。     

烟草抗PVY~N突变株eIF4E基因的克隆及表达差异分析

为了明确抗马铃薯Y病毒病的相关基因、进一步揭示其抗病机制,以烟草高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)突变株SN01和SN02为试验材料,研究了突变株的抗病相关基因翻译起始因子4E(e IF4E)在寄主中的抗病作用。结果表明:从抗病突变株SN01和SN02中克隆到目的全长基因,分别命名为e IF4E01与e IF4E02,其开放阅读框ORF长度均为669 bp,编码222个氨基酸;利用MAGA4.1和CLUSTAL软件进行序列同源性比对分析表明,e IF4E01和e IF4E02与已报道的烟草e IF4E(Gen Bank:AY702653.1)基因序列相似度均达到99%,其开放阅读框序列完全一致。并与甜椒、番茄、拟南芥等物种的e IF4E家族基因也具有高度同源性;Real-time PCR结果表明,在PVYN侵染初期(接种后0~9 d),突变株SN01和SN02中的e IF4E基因表达量明显低于其感病亲本NC89和K326。说明这两个抗病突变株中的e IF4E基因的抑制表达与烟草对PVYN的抗性密切相关。     

胁迫温度下两株高致病性副溶血弧菌的生长差异比较分析

为了比较胁迫温度下高致病性副溶血性弧菌的生长差异,作者选用致病性副溶血性弧菌ATCC 33847(tlh~+/tdh~+/trh~-)和F 18(tlh~+/tdh~+/trh~-),测定其在南美白对虾上4~30℃的生长情况,采用修正一级模型拟合其生长曲线,并基于最优模型拟合得到的最大比生长速率(μmax)、延滞期(LT)比较分析两株菌的生长特性。结果表明,20~30℃时,两株副溶血性弧菌并未呈现出明显生长差异,而4~15℃时的生长差异较大。修正Gompertz模型为ATCC 33847和F 18在15~30℃的生长曲线的最优模型(R~20.99),Baranyi模型为ATCC 33847在4~7℃以及F 18在7℃下最优模型(R~20.935),而F 18在4℃和10℃的生长模型有待于进一步研究。15~30℃,F 18的μmax大于ATCC 33847,差值约从0.2 lg(cfu/mL)/h增至0.8 lg(cfu/mL)/h,ATCC 33847的LT大于F 18,差值从2.5 h变化到7 h。比较其他同类文献的μmax二级模型发现高致病性菌株存在显著性生长差异(P0.05),且差值随着温度的升高而变大。因此,胁迫温度下相同致病性副溶血性弧菌的生长存在较大的异质性,而结合微生物实际生活环境,建议考虑建立以混合菌株为研究对象的预测模型,为风险评估提供更准确的数据基础。