木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

研究了木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质。以缓冲液从木薯块根中获得粗提酶液,粗酶酶活力为9.37 U/g木薯干重;再分别通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.14 U/g木薯干重,经纯化β-葡萄糖苷酶纯度提高了14.62倍,总活力回收率为12.14%,电泳测得其分子量约70 kDa。该酶米氏常数K_m为3.60 mmol/L,V_max为12.36μmol/(min·mg protein);其最适pH为7.0,pH在6.0～8.0之间有较好的稳定性;在40℃以内有良好稳定性,在4℃存放30 d酶活力剩余81.78%。Mn²⁺和K⁺对酶有一定的促进作用,Al³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、尿素和SDS对酶没有显著影响(P>0.05),而Fe³⁺、F...     

黑曲霉脂肪酶Lip A的异源表达与酶学性质分析

脂肪酶在油脂分解和脂质合成方面具有广泛应用，是一种很有前途的生物催化剂。该研究对来源于黑曲霉的脂肪酶Lip A进行了异源表达及催化特性研究。结果表明，该重组脂肪酶的最适温度为50℃,最适pH为8.0,并且在40～60℃和pH 5.0～8.0有较好的稳定性。该酶对有机试剂有较好的耐受性，金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对脂肪酶水解活性有促进作用，Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺严重抑制该酶活性。反应动力学参数表明，对硝基苯酚乙酸酯是脂肪酶Lip A的最适底物，其反应K_m为(0.228±0.05) mmol/L,催化常数K_cat为(0.023±0.001) s^-1。生物信息学分析表明，脂肪酶Lip A是abH23同源家族Rhizomucor mihei脂肪酶中的一员。黑曲霉脂肪酶Lip A具有催化乳酸和乙醇生成乳酸乙酯特性，为其在酿造领域的应用奠定了基础。     

降解β-胡萝卜素双加氧酶的分离纯化及其部分酶学性质

研究了西方许旺酵母菌发酵产生双加氧酶的分离纯化及其酶学特性,并利用该酶降解β-胡萝卜素生成香味物质。通过摇瓶发酵,并对粗酶液进行硫酸铵梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadax G-100凝胶过滤等处理,得到转化β-胡萝卜素生成香气物质的双加氧酶。实验结果表明,西方许旺酵母菌发酵产生的双加氧酶被纯化了36.43倍,酶活力回收率为21.0%,分子量为55.0 ku。酶的最适温度为40℃,最适p H为8.5;金属离子对降解β-胡萝卜素双加氧酶活力的影响为:Fe²⁺>Mg²⁺>K⁺>Na⁺>Mn²⁺>Cu²⁺>Ca²⁺>Zn²⁺>Ag⁺。Fe²⁺和Mg²⁺能明显增强酶活力,而Zn²⁺和Ag⁺能抑制酶活力;SDS和胃酶抑素对酶活力有显著抑制作用。降解β-胡萝卜素双加氧酶的K_m=8.24×10^-4mol/L,V_max=2.16×10^-4mol/（min·mg）。      

双齿围沙蚕β-1,3-葡萄糖苷酶分离纯化及其酶学性质

从双齿围沙蚕中提取、分离纯化β-1,3-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。通过80%饱和度（NH4）2SO4沉淀从双齿围沙蚕中得到粗β-1,3-葡萄糖苷酶,粗酶依次经DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析进行分离纯化。酶纯化倍数为35.74,回收率为39.49%。SDS-PAGE检测表明其分子量为28.7 k Da。该酶最适温度为50℃,最适p H为7,Km为8.2×10-4mol/L,Vmax为3.2×10-4μmol/h。金属离子K+、Mg²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力影响较小,Al³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ag⁺对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力抑制较大,其中Zn²⁺抑制作用最强。双齿围沙蚕可作为β-1,3-葡萄糖苷酶的潜在来源。      

单宁酶的研究与应用

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子PglaA6R和信号肽SglaA,构建单宁酶基因AnTan黑曲霉重组表达载体pSZHG6R-AnTan,采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得单宁酶黑曲霉纯合重组菌株A1。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测结果表明,目的蛋白大小约为76 kDa;以10%糊精为碳源摇瓶发酵至11 d时,酶活最高达到134.36 U·mL⁻¹,约为宿主菌株的192倍。酶学性质研究表明,最适温度为50 ℃,高温时热稳定性较差;最适pH为7.0。K⁺和Ca²⁺对重组酶没有影响;Mg²⁺对重组酶有微弱的促进作用;Zn²⁺对重组酶有明显的促进作用;Cu²⁺和Fe²⁺对重组酶有微弱的抑制作用;Mn²⁺和EDTA对重组酶有明显的抑制作用。研究结果为进一步优化单宁酶的分泌表达提供了有价值的参考。     

Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性

目的：对菌株Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行基因克隆、异源表达、纯化及酶学性质研究,为后期开发新的淀粉加工用酶打下基础。方法：使用PCR技术对Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶bmal基因序列进行全长克隆,异源表达,使用Ni²⁺-NTA进行纯化,再对其酶学特性进行测定,使用序列分析工具BioEdit、MEGA等对其氨基酸序列进行分析,使用AlphaFold2对其三级结构进行预测分析。结果：BMAL基因全长1770 bp,编码一个589氨基酸残基的蛋白。重组酶rBMAL经Ni²⁺-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小为63 kDa。氨基酸序列分析和三维建模表明BMAL与来源于B.subtilis 168和B.subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶有较高的一致性,且BMAL具有一个麦芽糖淀粉酶所独有的N端结构域以及由Asp328-Glu357-Asp424三个氨基酸残基所构成的催化中心。重组酶rBMAL最适反应温度为45 ℃,最适反应pH为6.0。重组酶rBMAL在30 ℃条件下保藏7 h残留酶活为60%,但在60 ℃条件下保藏2 h残留酶活力下降98%,说明BMAL对热敏感。重组酶rBMAL在4 ℃,pH7.0~9.5保藏12 h活性稳定。当存在1 mmol/L的金属离子Mg²⁺时,重组酶rBMAL活力提高36%,而Ni²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Ca²⁺对重组酶rBMAL有抑制作用,酶活力减少85%~48%。有机溶剂和化学试剂甲醇、乙醇、丙酮、异腈、EDTA和SDS对重组酶rBMAL有较强的抑制作用,酶活力减少至32.3%~64.8%。底物特异性实验结果证实BMAL最适底物为环精糊。结论：Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL具有良好的催化特性和pH稳定性,在面包烘焙工业上具有潜在的应用价值。     

白酒酒糟中产纤维素酶细菌的分离筛选和酶学性质研究

从白酒酒糟中获得产纤维素酶细菌,利用刚果红平板初筛、摇床发酵复筛等手段进行分离筛选,结合形态学、分子生物学鉴定及生理生化特征对菌株进行分类鉴定,并对其酶学特性进行了研究。结果表明,从酒糟中共筛选得到16株产纤维素酶菌株,其中YS10-2酶活力最高,羧甲基纤维素(carboxy methyl cellulose,CMC)酶活力为36. 73 U/m L,经鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。其胞外纤维素酶最适反应温度为50℃、最适p H值为5. 0,具有一定的热稳定性,在弱酸性的条件下较稳定,金属离子Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺对酶活力有促进作用,而Cu²⁺和Ba²⁺则抑制酶活性,纤维素酶的最适反应底物为CMC。     

产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株筛选、鉴定与酶学性质的初步研究

从上海浦东新区新场镇某农场种植田筛选出1株高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,初步研究其酶学性质,以获得有良好热稳定性和pH稳定性的酶。通过形态学特征、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列比对分析,确定该菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans),命名为P.macerans TLLY7。酶学性质测定结果表明,该酶的酶活性为1.35 U/mL,其最适反应温度为50℃、最适反应pH值为6.0,并且在40~45℃、pH 6.0~9.0稳定性良好。Ca²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对酶表现出促进作用,Fe²⁺、Cu²⁺和Co²⁺则对该酶表现出抑制作用。其中Ca²⁺对酶的促进作用最强,酶活性促进率为25%,Cu²⁺对酶的抑制作用最强,酶活性抑制率为33%。K⁺、Mg²⁺对酶活性的影响较小。菌株TLLY7所产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质初步研究表明其具有深入研究的价值和应用的潜力。     

黑曲霉突变菌株产糖化酶的酶学特性表征

以电子束诱变黑曲霉突变菌株为对象,通过最适pH试验、最适作用温度试验、热稳定性试验、酸碱稳定性试验和金属离子对糖化酶活力影响的试验,探明黑曲霉电子束突变菌株产糖化酶的酶学特性。结果表明:突变菌株产糖化酶酶最适作用温度为63℃,且最高酶活较原始菌株提高26%,在80℃原始菌株所产糖化酶失活时,仍有8.4 kU/mL酶活剩余,突变菌株所产的糖化酶的热稳定性明显提高。突变菌株所产糖化酶最适pH为4.6,且最高酶活较原始菌株提高24%,在原始菌株所产糖化酶失活时仍有6.9 kU/mL酶活剩余,突变菌株糖化酶的pH稳定性有着明显提高。K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺可在一定程度上增强其活力;Ag⁺、Fe²⁺、Cu²⁺则在不同程度上抑制糖化酶活力;Zn²⁺、EDTA对其酶活力影响较小或无明显现象。     

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH₄)₂SO₄沉淀、透析、DEAE-Sepharose 离子交换层析及 Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53%。酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50 ℃,40~50 ℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5~7.5内酶活力表现稳定;金属离子对酶活性的影响实验表明,Na⁺、K⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg²⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Li⁺、Cu²⁺具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类。ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

蜡状芽孢杆菌CZ磷酸甘露糖异构酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将蜡状芽孢杆菌CZ中的磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）进行克隆,并在大肠杆菌中进行异源表达。将PCR扩增得到的pmi基因与p ET-22b（+）表达载体进行连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建重组菌株BL21-p ET22b（+）-pmi,并成功表达了重组磷酸甘露糖异构酶。结果显示:克隆得到pmi基因序列全长为948 bp,编码315个氨基酸。通过镍柱His Trap HP亲和层析法纯化得到具有活性的重组酶,其蛋白分子大小约为40.8 ku。酶学性质结果显示:该酶的最适反应温度为35℃,在30⁴0℃酶活力相对稳定;最适p H为7.0,在弱碱性条件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低浓度的金属离子Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Mg²⁺均对该酶表现出不同程度的激活作用,其中Mn²⁺对该酶激活作用最显著,当其浓度为1 mmol/L时,激活作用最大,而Co²⁺对其有明显的抑制作用。      

阿魏蘑漆酶同工酶的异源表达及酶学性质研究

共培养是提高漆酶发酵水平的一种有效手段,实验室前期研究发现,较之单培养,在阿魏蘑与胶红酵母的共培养过程中,阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6的转录水平发生了明显变化。通过克隆得到阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6,异源表达后对2个重组漆酶LACC2和LACC6进行分离纯化和酶学性质分析。以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]为底物时,LACC2和LACC6的最适反应温度和pH相同,分别为50℃和3.0;低浓度的K⁺、Cu²⁺、Co²⁺和Mn²⁺对2个重组酶有不同程度的促进,但对LACC2的促进作用更为明显;与LACC6相比,LACC2对有机试剂和表面活性剂的耐受力更强,但更容易受到抑制剂的影响;动力学研究发现,LACC2和LACC6的最适底物均为ABTS,K_m值分别为0.13和0.24 mmol/L。研究结果为共培养过程中胶红酵母促进阿魏蘑产...     

高产酸性β-葡萄糖苷酶的优良本土酵母菌株筛选、鉴定及酶学性质分析

为获得高产酸性β-葡萄糖苷酶及对葡萄酒生境耐受性良好的本土非酿酒酵母菌株,该文从452株本土非酿酒酵母菌株中通过逐步分析菌株发酵力、耐受性、高产β-葡萄糖苷酶能力和粗酶液的酶学性质,筛选目标酵母菌株。结果表明,452株非酿酒酵母菌株中72 h的CO₂失重量>0.51 g/100mL的菌株有221株;高产β-葡萄糖苷酶的菌株34株;菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370对葡萄糖、SO₂、酒精度和pH值均具有较好的耐受性,分别能耐受高糖350 g/L、酒精3%～6%（体积分数）、SO₂ 250 mg/L和低pH值2.5;其中菌株GC204、NM218、BF345均具有较高的β-葡萄糖苷酶活力,分别为54.34、49.5、46.42 mU/mL。酶学性质分析表明,菌株NM218和BF345中的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃,最适pH值为4.0;浓度为5 mmol/L的Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe^3+<...     

蓝莓中多酚氧化酶的酶学特性

为分析蓝莓中多酚氧化酶的酶学特性,本文对影响蓝莓多酚氧化酶（PPO）的酶活力的主要因素:p H、温度、金属离子、抑制剂及热稳定性进行了研究。结果表明:蓝莓中PPO最适p H为6.5,最适温度为30℃,Ca²⁺和Mn²⁺对蓝莓PPO有抑制作用,Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对蓝莓PPO有激活作用。柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸及亚硫酸氢钠能抑制PPO酶活,但柠檬酸抑制效果较差。热稳定性实验结果表明:蓝莓果PPO耐热性较差,高温短时可显著抑制PPO酶活性。      

曲霉来源果胶裂解酶PnlF的克隆表达及酶学性质分析

果胶裂解酶是一类通过β-消除机制降解果胶的多糖裂解酶，对果胶的利用具有重要意义。该研究利用真核表达载体，克隆表达了来自曲霉属Aspergillus costaricensis的酸性果胶裂解酶PnlF,经过亲和层析和凝胶过滤层析对该酶的发酵液进行了分离纯化，并对其酶学性质和降解果胶的产物进行了系统性研究。该研究成功实现了PnlF在毕赤酵母中的分泌表达，粗酶活力达到526 U/mg。PnlF的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0;其酶活力在20～30℃及pH 5～6内稳定。Ca²⁺和Mg²⁺可以大幅度提高PnlF的活力；而Ag⁺和Cu²⁺则会严重抑制其活力；此外SDS、TritonX-100、苯甲磺酰氟等化学试剂对该酶活性的抑制作用较强。     

产气肠杆菌B19中β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将产气肠杆菌B19中的β-甘露聚糖酶基因(ManE)进行克隆,获得全长ManE基因序列,将ManE基因与pET28a(+)表达载体连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21(DE3)-pET-28a(+)-ManE,并成功表达了重组β-甘露聚糖酶。结果表明:克隆得到ManE基因序列全长为2196 bp,编码731个氨基酸。通过Ni柱亲和层析法分离纯化得到纯度较高的重组β-甘露聚糖酶,其分子量大小约为82.5 ku。重组β-甘露聚糖酶的酶学性质研究结果显示:最适反应温度和最适pH分别为55℃和6.5,在温度50~55℃,pH4.0~7.0的范围内都能保持较好的稳定性。1 mmol/L浓度的Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺和Ca²⁺对重组β-甘露聚糖酶的酶活有不同程度的激活作用。而K⁺、Mg²⁺和Cu²⁺对该重组酶有不同程度的阻碍作用,其中Cu²⁺对该重组酶催化活性的抑制作用最强,酶活降低到最大酶活力的65.3%。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,这些结果为该酶的进一步工业化应用提供了重要的理论依据。     

人体肠道中产尿酸氧化酶细菌的筛选、鉴定与酶学性质研究

该文从人体肠道中筛选出1株产尿酸氧化酶菌株,经形态观察及分子生物学(16S r DNA测序)鉴定为彭氏变形杆菌,命名为Proteus penneri JC-5。随后对其所产尿酸酶进行酶学性质研究,实验结果表明,该酶最适作用温度为35℃,热稳定性较差;最适p H 8. 0,在弱碱条件下有较好稳定性; Ca²⁺与Mn²⁺对该酶有激活作用,Ca²⁺激活作用较强,Fe²⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对该酶活性有抑制作用。     

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40⁵0℃具有良好的稳定性;p H5.5⁸.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca²⁺、K+、Zn²⁺、Mn²⁺、Na+、Mg²⁺对酶活具有抑制作用,Cu²⁺对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。      

产高聚合度IMOs右旋糖酐酶菌株Cellulosimicrobium sp. Y1的筛选及酶学性质研究

右旋糖酐酶在制糖、医药、材料制备和生物技术等领域应用广泛。该研究从连云港羊山岛海域海泥样品中筛选分离出一株产右旋糖酐酶的菌株Cellulosimicrobium sp. Y1，对其生长、产酶条件、酶学性质以及酶解产物进行了研究：在pH7.0、温度30℃条件下生长最优。在10 g/L右旋糖酐T20、pH9.0、温度35℃条件下发酵36 h产酶量最高。该酶的最适作用温度和pH值分别为40℃和7.5。金属离子Mg²⁺、Sr²⁺、NH₄⁺及低浓度的Li⁺、Ca²⁺、Mn²⁺可以提高酶的活力，而Ni²⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺对该酶有不同程度的抑制作用。同时，吐温、乙醇、二甲基亚砜和尿素等有机溶剂对该酶的活力影响较小。右旋糖酐酶的分子质量约为55 ku，可以特异性地水解α-1,6糖苷键，其酶解产物中主要为异麦芽三糖和异麦芽五糖，酶解1 h的产物中，高聚合度的...     

中村芽胞杆菌壳聚糖酶在大肠杆菌中重组表达及酶学性质

壳聚糖是一类来源丰富的大分子聚合物,在化工、食品、生物等多个领域都有广泛的应用价值,然而,只有降解成小分子的低聚糖才能更好地发挥其活性。随着酶法降解壳聚糖相较于其它方法的优势愈来愈明显,探索新型稳定高效的壳聚糖酶引起研究者的关注。参考GeneBank数据库中中村芽胞杆菌(Bacillus nakamurai)的壳聚糖酶氨基酸序列设计相应的编码基因,利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化重组蛋白。酶学性质研究结果显示:该酶在最适温度37℃,46℃处理30min时仍有50%的相对酶活,最适pH值4.5。在pH 2.5条件下处理60 min时,仍可保持60%相对酶活。Ag⁺、Hg⁺完全抑制酶活性,Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活性有促进作用,K⁺、Na⁺、EDTA对酶活性无明显作用。本文首次研究来源于中村芽胞杆菌的壳聚糖酶的酶学性质,以拓展该酶库资源,为该酶后续研究和应用提供理论依据。