CRISPR- Cas12a 检测牛奶中大肠杆菌方法的建立与评价

为提高牛奶中大肠杆菌的检测效率,简化分析流程,该文建立基于成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）的牛奶中大肠杆菌快速检测体系。首先,构建CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated protein,CRISPR-Cas）,CRISPR-Cas12a 的重组表达质粒,并将其转化至BL21 感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达Cas12a 蛋白。然后,通过麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）亲和层析、凝胶过滤层析等方法将Cas12a 蛋白进行纯化。最后,设计靶向大肠杆菌16S rDNA 目的片段的特异性CRISPR RNA（crRNA）,将特异性的crRNA、大肠杆菌16S rDNA 的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）胶纯化产物和纯化的Cas12a 蛋白进行混合,建立CRISPR-Cas12a 靶向切割体系。验证结果显示该体系可用于检测牛奶样品中的大肠杆菌。     

亮氨酸氨肽酶LapA在无孢黑曲霉中的重组表达优化及酶学性质

针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65 ℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展

食源性病原菌引起的食品安全事件引起广泛关注,为保证食品安全,采取有效的检测手段至关重要。新兴的簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其关联蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统,可高效、特异性识别并切割外源核酸,与传统技术相比在检测病原菌方面更为高效。本文基于CRISPR/Cas生物传感系统-等温扩增技术联用的相关研究进行综述,对CRISPR/Cas系统的分类、原理以及与等温扩增耦合后在食源性病原菌检测方面的研究进展进行概述,并对其在即时检测应用中的前景以及所面临的挑战进行深入探讨,以期为CRISPR/Cas生物传感系统的进一步发展提供参考。     

CRISPR核酸检测技术的研究进展

作为一种新兴的基因组编辑和调控工具,CRISPR技术的诞生和发展极大地改变了生物学领域的前进方向。近几年来,CRISPR系统及其相关蛋白(Cas效应蛋白)的工作原理被逐渐揭示,由于其优越的灵敏度和特异性,该技术在多个领域开始发挥至关重要的作用。借助其新颖的核酸酶活性,人们打开了研发核酸检测新方法的大门。本文总结了多种CRISPR/ Cas系统及其在核酸检测领域的应用和局限性,并对其后续发展方向进行了展望。随着该技术的不断成熟,CRISPR/ Cas系统将进一步推动基础生物学和应用生物学的研究,并有潜力成为下一代诊断生物传感平台的候选者。     

单核细胞增生李斯特菌ladR基因在两种原核表达载体中的克隆表达及纯化分析

利用特异性引物扩增ladR基因序列,分别构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ladR基因的两种原核表达载体,即含有6个His标签的pET-28a-ladR表达载体和含有GST标签的pGEX-4T-ladR表达载体。通过诱导时间、温度和浓度优化两种表达载体的蛋白表达条件,比较分析两种表达载体的LadR蛋白可溶性表达水平,利用Western-Blot进行LadR蛋白表达验证。本研究成功构建了pET-28a-ladR和pGEX-4T-ladR表达载体,在大肠杆菌BL21中分别表达出His-LadR和GST-LadR融合蛋白。通过凝血酶切除GST标签,纯化后得到LadR蛋白。在最佳表达条件IPTG为0.5 mmol/L,22 ℃诱导过夜下,pGEX-4T-ladR表达载体中LadR的表达量比pET-28a-ladR（IPTG为1.0 mmol/L,22 ℃诱导过夜）中His-LadR蛋白的表达量高4.48倍。本研究结果表明,GST标签有利于ladR基因的可溶性表达,为后续的LadR蛋白的功能分析和转录调控机理研究奠定了良好基础。     

CRISPR/Cas系统在大肠杆菌代谢与发酵工程中的应用

大肠杆菌广泛应用于发酵和代谢工程等生物领域。通过基因工程的手段改造和调控大肠杆菌的代谢途径有着重要的应用价值。近年来,人们利用CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中开发了一系列遗传操作工具。本文在简要介绍CRISPR/Cas系统的基础上,重点阐述了其在大肠杆菌基因组编辑和基因表达调控方面的研究现状,结合笔者自身的研究提出开发更高效更精准的基因组编辑工具的思考方向,为在大肠杆菌中应用CRISPR/Cas系统开展相关工作提供参考。     

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达

应用PCR扩增嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC,重组至原核表达载体pET30b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达的重组乙醛脱氢酶在碳端含有一个组氨酸标签。SDS-PAGE考察蛋白的表达量和亚基分子量,并对Km值进行了考察。成功构建了pET30b-aldC原核表达质粒;诱导表达了亚基分子量约为56 kDa的组氨酸融合蛋白;乙醛脱氢酶活性比对照菌增加了约3.5倍;Km值为2.874 mmol/L。成功克隆并诱导表达了含组氨酸标签的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC。     

II型CRISPR系统在微生物中的应用

CRISPR系统是一种新兴的基因编辑技术,是存在于部分细菌中的一种免疫反应系统,利用Cas基因编码的蛋白对进入细胞中的外源DNA进行高效识别并切割,保护细菌自身免受外源基因侵害。CRISPR系统主要应用于基因的定点敲入和敲除。该系统具有操作简便,适用范围广等优点,已在各类微生物和动植物中广泛应用。在CRISPR系统中,II型CRISPR系统是应用最为广泛的系统,是目前的研究热点。它包含CRISPR/ Cas9、CRISPRa和CRISPRi系统,由于CRISPRa系统目前应用较少,本文对CRISPR/ Cas9和CRISPRi系统在微生物中的应用研究现状进行综述,并对两种系统未来的发展进行展望。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因（epEGF）的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组大肠杆菌株BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测新技术中的研究进展

食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和关联蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,其高效特异序列识别及切割活性的特性,为食源性致病菌高灵敏、快速检测提供了一种新的途径。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制及发展,总结了近年来基于CRISPR/Cas系统结合不同结果报告方式用于食源性致病菌快速检测的最新进展,并对其优势、局限性和未来发展方向进行了讨论。     

CRISPR/Cas系统的核酸检测及其在食品安全快速检测中的应用

近年来,快速检测技术成为食品安全领域的一个重要研究方向。成簇规律间隔短回文序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白(Cas)组成的CRISPR/Cas系统因优越的靶向性而被广泛应用于核酸检测中。基于CRISPR/Cas系统的核酸传感器具有灵敏度高、特异性强、时效性快等优势,成为快检领域的研究热点,也推动了食品安全快速检测技术的发展。本文基于CRISPR/Cas系统进行综述,分析不同的CRISPR/Cas系统结合核酸技术在靶标检测中的应用情况,展望CRISPR/Cas核酸传感器在食品安全快速检测领域的未来研究方向,为研发基于此核酸传感器的新型检测方法提供参考。     

大肠杆菌中吡咯喹啉醌合成途径的构建

目前吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）在大肠杆菌中的异源合成主要以质粒为表达载体进行,但是质粒载体难以进行合成途径多基因表达的系统优化,并且容易造成发酵不稳定。作者以大肠杆菌为底盘生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在基因组水平系统优化PQQ的合成。将来源于Gluconobacter oxydans 621H的操纵子pqqABCDE引入底盘大肠杆菌,并进一步通过优化合成途径基因表达强度,敲除大肠杆菌自身抑制基因及强化PQQ的胞内需求与胞外转运等,获得了一株能够高效合成PQQ的工程菌,摇瓶发酵72 h时产量达到86.3 mg/L。以大肠杆菌为底盘构建PQQ高效合成途径的工作能够为后续以其他底盘生物生产PQQ及相关代谢产物提供借鉴。     

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

扩增型和非扩增型CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测领域应用的研究进展

食源性致病菌引起的食品安全事件频发已对公众健康和社会经济造成巨大的影响,构建针对其快速、高效的检测方法是保障食品安全的重要手段。成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,可以有效地识别并切割外源核酸。因此,可以利用CRISPR/Cas系统这一对外源核酸的识别及切割活性实现对食源性致病菌的快速高效检测。本文详细介绍基于核酸扩增和免核酸扩增的两种CRISPR/Cas系统,综述其在对各种食源性致病菌检测中的应用,讨论它们的优势、局限性以及未来的发展趋势,旨在为建立更高效的食源性致病菌检测方法提供技术参考,以期更有效地减少食源性致病菌造成的食品安全问题。     

CRISPR/Cas系统在食品质量安全检测中的应用研究进展

规律间隔成簇短回文重复序列(regularly spaced clustered short palindrome repeats-associated, CRISPR/Cas)系统是基于原核生物的一种适应性免疫系统, 因其可编程性和易操作的优点已被开发为基因编辑技术, 并且凭借其快速和高效的特点被广泛用于生物、医学等领域。目前, CRISPR/Cas系统已开始在基于核酸检测和单核苷酸多态性检测等食品安全检测技术中应用。本文就CRISPR/Cas系统中Cas9、Cas12a和Cas13a的原理以及其在掺假检测、溯源检测、食源性微生物和动物疫病等食品质量安全检测中的应用进展进行了综述, 以期为CRISPR/Cas系统应用于食品质量安全的快速现场检测提供理论和技术参考。     

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR/Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR/Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。     

CRISPR/Cas9介导的酿酒酵母ADH2基因中断及反义RNA干扰GPD1的表达

CRISPR/Cas9是一个简单、高效的用于靶向目的基因和无标记的基因组工程的工具。本文通过构建酿酒酵母沉默组件PGK-SGPD1-CYC1,使甘油-3-磷酸脱氢酶I(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPD1)基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在中断乙醇脱氢酶Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ,ADH2)基因的同时,定点敲入GPD1基因的反义干扰组件,从而特定地干扰GPD1的表达。采用高效的酵母化学转化法将反应组件敲入酿酒酵母Y1H中,CRISPR/Cas9介导的同源重组效率达43.48%,由此获得了ADH2基因中断和GPD1反义干扰的酿酒酵母突变株。发酵实验结果表明,酿酒酵母突变菌株SG1-1与出发菌株Y1H相比,乙醇产率提高了9.07%,甘油产率下降了12.05%,乙酸产率下降了12.30%,结果表明通过中断ADH2基因及插入GPD1反义干扰组件,既能够中断ADH2基因的功能,减少乙醇转化为乙醛,同时也能在一定程度上干扰GPD1基因的表达,提高乙醇产率。