食品中产志贺毒素大肠杆菌的多重PCR检测

针对产志贺毒素大肠杆菌的stx2、wzy、hlyA的保守序列,设计特异性的引物,建立一种新的多重PCR检验方法.结果显示,该方法特异性强,扩增结果与各参考菌株基因型一致,并能良好的区分出O157菌株和非O157型产志贺毒素大肠杆菌.该方法能用于食品样品的检测和流行病学分离株的快速鉴定.     

产志贺毒素突变株的毒力分析

对2株食物中毒病人体内分离的产志贺毒素突变株EC130和EC169进行毒力分析。EC130和EC169携带stx基因但不能正常表达志贺毒素,具有eae基因和hly基因,仍具有一定毒力。初步探讨了产志贺毒素突变株不能正常表达志贺毒素的机理,高产志贺毒素的对照株携带Q933基因,而EC130和EC169不携带Q933基因。结果表明,单一采用志贺毒素作为检测靶标,容易造成产志贺毒素突变株漏检,今后在检测食品中产志贺毒素株时应增加检验eae基因和hly基因。     

利用EHEC琼脂平板从食物中分离检测产志贺毒素大肠杆菌

为利用肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)琼脂平板,从食物中分离、检测产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC),采用STEC毒力基因(hlyA基因)检测溶血素的产生,建立了一种利用EHEC琼脂平板快速、准确地从食物中分离、检测STEC的方法。该方法可检测STEC不同血清O157∶H7、O26、O111。     

武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌污染状况分析

对武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)污染状况进行分析。方法 2011年7月至2012年10月期间,从武汉市汉口30个菜场和超市共采集样品196份,其中猪肉102份,牛肉60份,禽类34份。通过选择性增菌,提取DNA,PCR扩增stx1、stx2、rfbO157、wzyO157基因,分析食品中产志贺毒素大肠杆菌的污染状况。结果 猪肉、牛肉、禽类食品中非O157型STEC的阳性检出率分别为18.6%、48.4%和2.9%;O157型STEC的阳性检出率分别为13.6%(猪肉)、6.7%(牛肉)和2.9%(禽类)。菜场样品STEC检出率(35.8%)略高于超市样品(32.4%)。结论 武汉市肉类食品中STEC检出率较高,应定期跟踪监测,了解菌株流行和毒力变化状况。     

检测产志贺毒素大肠杆菌的菌落PCR方法

针对产志贺毒素大肠杆菌的毒力基因stx 设计特异性引物,并建立一种菌落PCR 方法。菌落PCR 模拟实验证实,该方法特异性强,能良好的扩增出O157 的stx1 和stx2 基因,而普通大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌则无PCR 扩增产物。应用分子检测初筛、选择性培养、菌落PCR 相结合的方法,检测实际食品样品,分离检测到一株携带 stx1 的产志贺毒素大肠杆菌。本实验建立的菌落PCR 方法可应用于食品检验。     

食源性产志贺毒素大肠杆菌的分离及菌株特征分析

了解不同食品中产志贺毒素大肠杆菌的流行情况、菌株特征及潜在致病性。方法 对我国不同地区采集的355份食品样品进行产志贺毒素大肠杆菌分离鉴定,对菌株进行stx1/stx2基因分型、eae等毒力基因检测,并对菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。结果 355份样品中44份stx2基因阳性,共分离出11株非O157 产志贺毒素大肠杆菌,其中3株携带stx2a亚型,3株携带stx2e亚型,1株携带stx2b亚型,4株不能分型;5株携带ehxA、saa毒力基因,2株携带subA基因,1株携带katP基因;MLST将11株菌分为7个不同的ST型,存在与溶血性尿毒综合症患者肠出血性大肠杆菌分离株(HUS-associated enterohemorrhagic E.coli,HUSEC)及主要流行血清群产志贺毒素大肠杆菌亲缘关系较近的ST型别。结论 我国食品中存在一定程度的非O157产志贺毒素大肠杆菌污染,部分菌株具有潜在致病性,应加强对食品中STEC的监测。     

大肠杆菌O157的志贺毒素基因克隆和测序

将一株大肠杆菌O157PCR扩增stx2基因全长并克隆测序。该菌株stx2基因与GenBank数据库收录的stx2基因最高同源性为98%,在3个核苷酸位点存在基因突变。采用邻位相连法构建进化树,序列分析结果表明O157为stx2C基因亚型。了解大肠杆菌O157的基因突变情况,并为开发大肠杆菌分子检测方法提供了参考。     

伊犁地区肉牛源产志贺毒素大肠杆菌的血清型和ERIC-PCR基因型研究

目的:了解产志贺毒素大肠杆菌在伊犁地区肉牛养殖环境和加工环节中的污染状况及其遗传多样性,为产业链中食源性致病性大肠杆菌的风险监测和控制提供基础数据。方法:采用传统方法和PCR方法对养殖环节的饲草料和粪便及屠宰环节的553份样品进行产志贺毒素大肠杆菌的污染调查,对分离鉴定的产志贺毒素大肠杆菌进行7种常见血清型（O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121）的PCR检测和ERIC-PCR的基因分型。结果:检测553份样品中有39株编码志贺毒素基因,产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的检测率是7.1%。常见血清型PCR检测中血清型O111有2株菌,检出率是5.1%;O145有5株菌,检出率是12.8%。ERIC-PCR基因分型产志贺毒素大肠杆菌有10种基因亚型,分成3簇,A簇有23株菌,相似性在59%¹00%,表明这些菌株之间的亲缘关系较近。结论:伊犁地区肉牛粪便是产志贺毒素大肠杆菌的污染源,这些菌株的亲缘关系较近。      

多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的 4个血清型

目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。结果本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法, PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp。多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于10~3～10~4 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/m L。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27%(4/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。结论以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌。     

食品中非O157大肠杆菌志贺毒素基因序列分析

对一株从食品中分离的非O157产志贺毒素1型大肠杆菌(EC6)进行研究。将该菌株所产志贺毒素Stx1用 PCR扩增stx1 基因全长并克隆测序,其stx1 基因与GenBank 数据库收录的stx1 基因最高同源性为99%,表明EC6 发生了一定程度的基因突变。采用邻位相连法构建进化树,结果表明EC6 为stx1 基因亚型。     

产志贺毒素大肠杆菌O26多重双启动寡核苷酸引物-PCR检测方法的建立

为建立一种三重DPO-PCR方法用于食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌O26的检测。以志贺毒素stx1和stx2、O抗原基因wzx O26特异性和实际检测效果,设计引物,构建三重DPO-PCR反应体系,进行特异性、灵敏度、模拟样品验证和实际样品验证。结果表明,三对DPO引物对退火温度不敏感,在49~69℃之间均能发生扩增,且引物之间干扰较小,具有较高的特异性,除目的基因外非目标细菌均无扩增条带出现,纯菌灵敏度检测表明,三重DPO-PCR方法对O26的最低检测限为3.8×10^3 cfu/g。在模拟样品和实际样品中具有良好的检测效果。本研究基于DPO引物构建的三重DPO-PCR方法具有效率高,特异性强,不受退火温度限制等优点,可用于食品样品中产志贺毒素大肠杆菌O26的快速准确检测提供一种高效的辅助检测方法。     

成都周边某奶牛养殖场及市售生鲜牛肉中产志贺毒素大肠埃希菌监测与分析

目的 通过连续3年监测成都周边某奶牛养殖场犊牛和成年牛粪便、饲养环境及菜市场和超市生鲜牛肉中的产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）,了解本地区牛及牛肉中STEC菌株的携带及菌株特征情况,为评估该地区STEC污染状况、感染风险及防控策略提供科学依据。方法 采用荧光定量PCR法分离鉴定STEC,采用微量肉汤稀释法进行药敏试验。分离株全基因组测序后在EnteroBase数据库上获得MLST型别、菌株类型、血清型、毒力基因信息,使用Abricate软件比对得到stx亚型信息。用BioNumerics 7.6软件进行cgMLST聚类分析。结果 2019—2021年共采集奶牛养殖场牛粪和环境样品247份,25份检出STEC,检出率10.12%;采集生鲜牛肉294份,32份检出STEC,检出率10.88%;共分离到57株STEC。检出STEC菌株对氨苄西林耐药率最高,达42.11%（24/57）,其次为头孢噻肟和头孢唑啉（均占比38.60%,22/57）。多重耐药株占35.09%（20/57）。57株STEC共分离出30种血清型,其中可引起暴发的血清型有：O26：H11、O103：H25、O145：H12。通过毒力基因分析发现具有致病风险的亚型有：stx2a、stx2c、stx2d、stx2e、stx2g以及stx2k;及与疾病的严重程度密切相关eae-STEC及STEC/ETEC杂合株。结论 2019—2021年奶牛养殖场牛粪便和菜市场生鲜牛肉中STEC的污染持续存在。犊牛粪便检出率（21.43%）高于成年牛粪便检出率（0.91%）。菜市场生鲜牛肉STEC检出率高于超市。牛粪便中分离菌株比牛肉中分离菌株耐药情况严重。部分分离菌株因携带强毒力基因或其他致病相关基因而具有更强致病性。     

O26等产志贺毒素的6 种血清型大肠杆菌的暴发流行情况及检测研究现状

近年来,产志贺毒素而非O157的大肠杆菌,尤其是被美国农业部称为“the Big Six”的6 种大肠杆菌在诸多国家及地区暴发流行,严重威胁人类的健康,越来越受到世界各国的关注。“the Big Six”包括大肠杆菌O26、O45、O103、O111、O121、O145等6 种血清型。目前,在国内,关于“the Big Six”的报道及研究相对较少。文中介绍“the Big Six”的暴发流行情况,并对各种检测方法进行综述。     

基于毒力基因组合评价我国产志贺毒素大肠埃希菌潜在致病风险

目的 对我国不同来源产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）分离株的致病潜力进行分级,为STEC的风险管理提供参考依据。方法 运用联合国粮食及农业组织和世界卫生组织于2018年联合发布的STEC与食品归因、表征和监测报告中提出的危害等级分级方法,对我国2018—2022年已发表的STEC数据进行分级分析。结果 分级结果显示,纳入研究的STEC菌株中72.9%为低危害菌株,26.0%为高危害菌株,1.1%为最高危害菌株。高危害菌株主要来自牛或牛肉食品（95.3%）,仅有8株为最高危害菌株,分别来自牛和患者。结论 仅依据STEC菌株的血清型不足以作为菌株毒力评判标准,通过毒力基因组合对STEC感染风险进行分级是更可靠的方法。这一方法可为我国制定STEC监测和风险评估提供参考。     

前增菌抗生素添加对产志贺毒素大肠埃希氏菌分离的影响

目的 研究产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）国际标准检测方法中前增菌肉汤中抗生素种类和浓度对STEC分离的影响。方法 利用STEC和其他非STEC菌株，对国际现行检测STEC标准方法推荐的在前增菌步骤使用3种抗生素的最低抑菌浓度（MICs）进行测定。结果 不同抗生素对STEC抑制存在差异性。在推荐浓度下，吖啶黄及头孢磺啶会抑制stx1a和stx2b亚型STEC的生长，新生霉素则会抑制stx1a、stx1c、stx1d、stx2b、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g等亚型菌株的生长。此外，STEC与其他革兰氏阴性菌对吖啶黄、头孢磺啶、新生霉素的MICs无显著性差异（P<0.05）。而革兰氏阳性菌对这3种抗生素的MIC值显著低于革兰氏阴性菌（P<0.01）。结论 本文结果为STEC增菌方法的研发完善提供了有价值的证据。     

大肠杆菌O157志贺毒素1胶乳凝集试剂的研制

根据大肠杆菌933W志贺毒素1(STX1)基因的序列,设计合成寡核苷酸引物,以国内分离的大肠杆菌O157菌株94H的DNA为摸板,经PCR扩增志贺毒素1A亚基基因,扩增的基因克隆到原核表达载体pET-28a,在E.coliBL21中进行表达。用表达的STX1A产物免疫兔子,制备STX1A抗血清,从中提取IgG。合成胶乳,用提取的IgG与胶乳交连反应,研制出了敏感和简便的检测大肠杆菌O157STX1产生的胶乳检测试剂。     

发酵香肠在发酵过程中微生物变化的研究

该文对四种中式发酵香肠在成熟过程中的菌相变化以及理化变化进行了研究,结论如下:乳酸菌是发酵香肠成熟过程中的优势菌,乳酸菌在第7天达到了最大值108cfu/ml以上,在成熟干燥的后期,乳酸菌呈下降的趋势;葡萄球菌和微球菌在发酵香肠成熟过程中的变化趋势与乳酸菌很相似,在发酵阶段或灌肠后的一周内达到了最大值,但其数量远远低于乳酸菌,在成熟时期开始下降,并且下降速度比较大.     

发酵香肠成熟过程中的生化变化

本文综合概述了有关发酵香肠在成熟过程中的一系列复杂生物化学变化及其影响因素,并提出今后有关发酵香肠的主要研究方向.     

乳酸菌发酵香肠中风味物质变化的研究

研究了乳酸菌发酵香肠中风味物质的变化,结果表明:发酵香肠中的主要风味物质乳酸、游离氨基酸和游离脂肪酸含量在发酵过程中都有明显增加。添加纯菌种发酵24 h后,乳酸、游离氨基酸和游离脂肪酸含量分别达到0.94%、4.38%(干基)和1.40%(干基),鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸分别是发酵前的15.3倍和11.3倍。在成熟期,各种风味物质仍保持平缓增势。     

发酵香肠中微生物和理化变化的研究

本文主要研究了在五组不同发酵剂作用下,在香肠的发酵和成熟过程中微生物指标和部分理化指标的变化情况,并做出了相应的分析和结论。结果表明,各类发酵微生物的生长都是先上升后下降的趋势,乳酸菌在混合发酵组的生长比在单一菌种组的生长更旺盛,球菌的生长也受乳酸菌的影响,两者表现出协同作用。