利用双重PCR同时检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌方法的建立

建立能够同时检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的双重聚合酶链式反应(Polymerse chain reaction,PCR)的方法。分别根据沙门氏菌和克罗诺杆菌16S rDNA序列设计特异性引物Cro和InvA。对待检奶粉样本进行预增菌后,提取菌液基因组DNA作为模板,进行双重PCR扩增,对其特异性、灵敏度和抗杂菌干扰能力进行评估。结果表明:两对引物分别可特异性扩增出140、630bp的目的条带。双重PCR同时检测婴幼儿配方奶粉样本中两种食源性致病菌的方法具有较高灵敏度,在经过4h预增菌后可检测到初始浓度为100CFU/g的克罗诺杆菌和初始浓度为100CFU/g的沙门氏菌,且在高浓度杂菌干扰下,灵敏度无下降。在人工污染奶粉样本检测中,两种致病菌的检出准确率均达95%以上。初步建立了能同步、快速、准确、灵敏地检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的双重PCR方法。     

LAMP在阪崎克罗诺杆菌检测中的研究进展

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一类食源性致病菌,可引起新生儿脑膜炎、败血症等疾病.环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是一类新型的恒温核酸扩增技术,具有灵敏度高、耗时短、特异性强、对设备需求低等特点,可与多种检测方法...     

免疫磁珠结合显色平板快速检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌

该研究利用羧基化磁珠偶联兔多克隆抗体,制备特异性免疫磁珠,并优化制备条件,然后与显色培养基联用,建立免疫磁珠-显色平板检测方法,用于富集分离婴儿奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明,磁珠与抗体的最佳偶联温度37℃、偶联时间2.0 h,1 mg磁珠的最佳抗体添加量为200μg,饱和偶联量为182.77μg。制得的免疫磁珠,捕获目标菌的浓度范围为10²～10⁷ CFU/mL,捕获率为68.4%～82.4%,与非目标菌反应率低于10%。检测方法应用于模拟污染样品,在目标菌浓度10²～10⁵ CFU/mL时,捕获率为66.2%～71.5%。相比传统方法,该方法的检测周期缩短了2～3 d。     

6种克罗诺杆菌精准鉴定及标准物质的制备研究

目的 制备具有我国食源性特点的6种克罗诺杆菌检验用标准物质.方法 通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及二代高通量全基因组测序技术...     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

克罗诺杆菌检测方法的研究进展

克罗诺杆菌是一种食源性致病菌,能够感染婴幼儿并导致坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和菌血症,死亡率最高可达80%。克罗诺杆菌广泛地存在于食品和自然环境当中,并且具有极强的抗干燥能力,因此容易污染乳粉和其原料并在其中长期存在。控制克罗诺杆菌的污染需要增强食品生产质量控制,也需要开发相应的检测技术。本研究主要从生理生化检测、免疫学检测技术、核酸检测技术等对克罗诺杆菌的检测方法进行综述,对上述各种检测方法的原理和优劣势进行了分析和总结,并且对克罗诺杆菌检测方法的未来发展进行展望。需要指出的是,由于克罗诺杆菌在婴幼儿食品中污染量低、婴幼儿食品基质成分复杂且检测要求高的特点,增菌培养是不同检测方法不可缺少的步骤并且是检测的限速步骤,未来还需要对这一环节进行更为深入的研究以提升检测效率。     

婴幼儿配方粉生产中克罗诺杆菌溯源研究

结合陕西省两个婴幼儿配方乳粉加工厂婴配粉生产工艺,对生产原辅料、车间环境、加工设备及工厂周边土壤进行采样,检测克罗诺杆菌的污染状况,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型溯源,定位克罗诺杆菌在生产过程的污染点.结果 表明,采集的1246份样品中检出14...     

双歧杆菌的质粒检测

实验通过3种方法对14株来源不同的双歧杆菌的质粒进行检测,发现只有一种方法可检测到1株长双歧杆菌(B-2778)存在着1个质粒,且质粒的分子量大约是23000bps;其它菌株在所用的3种方法均未检出有质粒存在。     

实时荧光PCR鉴定婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的研究

目的 建立一种能够快速准确鉴定克罗诺杆菌的实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法,并对食品样品和人工污染样品进行克罗诺杆菌检验。方法 根据克罗诺杆菌DNA旋转酶B亚基（gyrB）基因保守区序列设计引物和探针。通过特异性试验、绝对灵敏度、相对灵敏性试验、抗干扰试验对所建立方法进行方法学验证。采用人工污染样品增菌液进行方法灵敏度试验。结果 本研究建立的方法能够特异性扩增7种克罗诺杆菌,但对与其亲缘关系较近的其他肠杆菌及食品中较为常见的其他致病菌均无扩增,表明本研究建立的方法具有很好的特异性和抗干扰能力。采用阪崎克罗诺杆菌验证绝对灵敏度达1～10 pg,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL。在基因组水平和培养物水平均具有很好的抗干扰能力。人工污染样品在36℃增菌24 h后检测灵敏度可以达到100 CFU/mL。结论本研究所建立的实时荧光PCR方法对婴幼儿配方食品样品中的克罗诺杆菌的检测具有快速、特异、灵敏和稳定的特点,可以为传统婴幼儿配方食品中的克罗诺杆菌的检验提供技术参考。     

婴幼儿奶粉中阪崎克罗诺杆菌隐性污染状况分析及针对性检测技术研究进展

婴幼儿奶粉中存在的阪崎克罗诺杆菌对婴幼儿危害性极强,卫生标准中对该微生物有严格限制,但检出现象仍然时有发生。存在许多因素导致阪崎克罗诺杆菌在婴幼儿奶粉生产线中的潜伏,本文阐述了其在生产空间中的暴露特征,重点论述逆境胁迫下该菌耐受表型和活的非可培养表型形成的隐性污染对监测和清除污染残留的不利影响。讨论了各类检测技术的优缺点,强调检测灵敏度、回收率和区分活的非可培养状态菌对于控制隐性污染的重要性。以期为阪崎克罗诺杆菌的监测和防控提供新思路,为保障婴幼儿奶粉生产安全提供参考和建议。     

河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的分子分型及系统发育研究

目的 了解河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染情况、分子分型特征及耐药情况,分析不同菌株间的系统发育进化关系。方法 采集婴幼儿配方食品227份,按照GB 4789.40—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行克罗诺杆菌的分离鉴定,并用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离株进行药敏实验和溯源分析,采用16S rRNA和多位点序列分型(MLST)方法进行种属鉴定和系统发育进化分析。结果 227份婴幼儿配方食品中检出13株克罗诺杆菌,分别属于阪崎克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌。13株克罗诺杆菌药敏结果显示头孢唑啉耐药率达到84.6%(11/13),PFGE分型得到7个带型,MLST共分为6个ST型,其中ST1为优势型别,相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型。结论 河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染以阪崎克罗诺杆菌为主,种属和基因型具有多样性,系统进化树分析结果显示MLST能够更好地说明种水平之间的亲缘关系。     

大肠杆菌DNA定性标准物质的制备及在枸杞子污染检测中的应用

选取大肠杆菌毒力基因escV、stx2和hlyA为靶标序列构建质粒标准品,快速检测大肠杆菌。通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序对所构建的重组质粒进行验证,传15代测序验证质粒稳定性。制备escV、stx2、hlyA质粒标准品,对标准品进行检测限、均匀性、稳定性和定性实验。然后利用escV、stx2和hlyA质粒标准品对枸杞子中大肠杆菌进行检测。通过菌落PCR和测序结果表明escV、stx2和hlyA标准品制备成功。PCR体系对质粒标准品检测灵敏度达pg级别,并具有特异性,传15代测序的结果表明质粒标准品具有稳定性。escV、stx2和hlyA质粒标准品检测限分别为3.93×10⁶、2.41×10⁵拷贝/mL和2.14×10⁵拷贝/mL,在25、4、-20℃条件下具有很好的稳定性和性质。escV、stx2和hlyA质粒标准品对34批枸杞子样品检测,escV、stx2没有被检测出,有3批枸杞子样品中检测出hlyA(检出率为8.82%)。参考GB 4789.6—2016《...     

婴幼儿米粉及乳粉中克罗诺杆菌的快速定量

以大分子合成操纵子序列MMS为靶标基因,研究建立了基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(TaqMan qRT-PCR)法以快速定量粉状婴幼儿食品(米粉及乳粉)中的克罗诺杆菌(Cronobacter spp.).结果表明,所建立的扩增体系特异性强(在供试的14种食源性细菌中,典型扩增曲线仅见于目标菌)、灵敏度高(对标...     

克罗诺杆菌在婴儿配方奶粉及其加工环境中耐受性和耐药性研究进展

克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种食源性致病菌,容易感染新生儿和低体重早产儿并引起坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症等疾病,致死率高达40%~80%,治愈后可能存在严重精神系统后遗症。由流行病学可知,婴幼儿感染克罗诺杆菌与婴儿配方奶粉（Powdered Infant Formula,PIF）的关系十分密切。近年来,克罗诺杆菌污染PIF事件频发并且因其耐药性给临床治疗带来巨大挑战,造成严重后果。究其原因,是由于该菌对PIF及其加工环境的耐受能力强,不易被完全消杀从而造成持续污染。因此,为详细了解克罗诺杆菌在不利条件下的生长特性,该研究从克罗诺杆菌耐热性、耐干燥性、耐酸碱性、耐紫外性以及耐药性多个角度综述目前克罗诺杆菌耐受性相关研究进展,以期为我国克罗诺杆菌的防控消杀以及临床治疗提供参考。     

GB 4789.40-2016和ISO 22964:2017方法检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌属的实验室适用性研究

克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌）可在婴幼儿配方粉（Powdered Infant Formula,PIF）中长期存活。随着食品贸易的全球化,人们对婴幼儿配方粉（PIF）中克罗诺杆菌的污染尤为关注。本文参照ISO 16140-2 2016中方法比对的原则要求,对检测PIF中克罗诺杆菌的中国标准方法 GB 4789.40-2016（参考方法）和欧盟标准方法 EN ISO 22964:2017（替代方法）进行了方法比较研究。共有12个外部实验室参与检测3个不同污染水平（0 MPN/10 g,1.299 MPN/10 g和2.210 PMN/10 g）下添加了测试菌株的576份盲样的测试。结果表明,在低污染水平和高污染水平下,GB 4789.40-2016的灵敏度分别为80.00%和81.16%,而ISO 22964:2017对应的灵敏度分别为90.00%和97.10%。无论污染程度如何,相对检测水平（RLODs）都低于接受限（AL=2.5）。同时,采用AOAC指南中提出的检测概率（POD）模型对统计数据进行了分析,结果显示替代方法和参考方法之间没有统计学上的显著差异。据此得出用于检测PIF中阪崎...     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

等温扩增技术在克罗诺杆菌属快速检测中的研究进展

环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶等温扩增技术、滚环扩增技术和依赖解旋酶扩增技术作为常用的4种等温扩增技术,被广泛应用于克罗诺杆菌的快速检测中.通过分析不同技术的原理并以近5年的具体应用为例,从增菌时间、检出限、鉴定时间、目标菌群、目的基因这几个方面进行系统比较,希望能对企业和监管部门在食品安全控制方面提供相关理论支持....     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。