基于噬菌体特异性的新型荧光酶联方法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7

目的对一种基于噬菌体特异性的检测食品中大肠埃希菌O157∶H7的新型荧光酶联方法(VIDASECPT)进行了评价。方法利用VIDASECPT、VIDASECO、BAXO157三种快速方法检测不同浓度大肠埃希菌O157∶H7标准菌株的生理盐水悬浮液,并对VIDASECPT和常规培养法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7进行了比对。结果 VIDASECPT检测大肠埃希菌O157∶H7的检出限为104 CFU/ml,并且不受大肠埃希菌背景菌的干扰,其他两种快速方法的检出限均为105 CFU/ml,其中VIDASECO易受到背景菌的干扰;检测不同食品基质中大肠埃希菌O157∶H7,当大肠埃希菌O157∶H7的浓度为104 CFU/ml时,VIDASECPT与常规培养法无统计学差异。结论 VIDASECPT方法检测大肠埃希菌O157∶H7具有快速、灵敏、抗干扰性强的特点。     

大肠埃希氏菌O157:H7能力验证结果分析及讨论

目的：从FAPAS能力验证样品(沙拉)中分离、鉴定大肠埃希氏菌O157:H7,分别判定两个样品是否检出目标菌。方法：本实验采用国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》(GB 4789.36—2016)第一法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)对能力验证样品进行鉴定。结果：样品M248d11A中未检出大肠埃希氏菌O157:H7,鉴定干扰菌株为大肠埃希氏菌;样品M248d11B中检出大肠埃希氏菌O157:H7,结果为满意。结论：在进行能力验证实验中,为避免交叉污染,尽量选择不同生物安全柜进行试验;MALDI-TOF MS对于血清型的鉴定可以参考聚类树状谱系图,但不建议作为判定的主要依据。     

我国食品中大肠埃希菌O157耐药及PFGE分子分型特征分析

了解我国食品中分离的110株大肠埃希菌O157的耐药及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型特征,完善我国食品中大肠埃希菌O157菌株特征的基础信息,为该菌的风险评估提供依据。方法 使用琼脂稀释法对确认的110株大肠埃希菌O157进行药敏试验,完成耐药特征的分析。参照美国疾病预防控制中心PulseNet试验方法,对110株大肠埃希菌O157,运用XbaⅠ酶进行酶切并完成PFGE分析,利用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析。结果 ①110株菌中,43株菌至少对一种抗生素有抗性。耐药率最多的前三种抗生素依次是四环素(30.0%,33/110),磺胺甲恶唑(29.1%,32/110),萘啶酸(26.4%,29/110);②一共有24个耐药谱,耐两种以上抗生素的菌株有34株,耐3种以上抗生素的多重耐药菌株有32株。最常见的三种耐药谱依次是SMX(6),AMP-NAL-SMX-SXT-TET(6),AMP-CHL-NAL-SMX-SXT-TET(4)/AMP-SMX-SXT-TET(4)/TET(4);③大肠埃希菌O157非H7 (O157∶hund)对所测试的抗生素的耐药率明显高于大肠埃希菌O157∶H7(χ²=72.010 P<0.05)。其中37株携带了志贺毒素基因的大肠埃希菌O157∶H7仅对磺胺甲恶唑(2.7%,1/37)、萘碇酸(2.7%,1/37)有耐药,没有多重耐药菌株;④通过不同种类食品中大肠埃希菌O157菌株耐药率比较发现,从生猪肉、生禽肉中分离的菌株耐药率相对高于其他食品种类;⑤PFGE分子分型研究显示菌株具有基因多态性,且可以很好将大肠埃希菌O157非H7和大肠埃希菌O157∶H7菌株区分开。结论 我国食品中分离的大肠埃希菌O157耐药现象严重。我们应加强养殖环节和零售环节食源性致病菌,特别是大肠埃希菌O157(包括产志贺毒素大肠埃希菌O157)菌株药敏特征的监测,探明食品与养殖环节菌株耐药的传播关系,并为国家制定科学的养殖业抗生素用药提供依据。     

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒

目的 以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing, SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测致病菌志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM,以及阪崎肠杆菌的一致性。方法 以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法。,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157：H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157：H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有高灵敏度、特异性强、准确度高,无一例漏检。     

2005-2007年我国食品中大肠埃希菌O157分离株tccP1基因的分布研究

目的 了解我国2005-2007年食源性疾病监测网分离的大肠埃希菌O157分离株中tccP1基因的分布情况及特点.方法 对89株食源性大肠埃希菌O157分离株运用PCR方法进行检测.结果 tccP1基因的阳性率为55.1%.结论 tccP1基因广泛存在于O157:H7大肠埃希菌中,在O157:非H7中检出率很低.其分布...     

快速检测大肠埃希菌O157:H7免疫层析试纸条的研制

目的建立一种快速、特异性强、方法简便和经济实用的检测大肠埃希菌O157：H7的免疫学方法。方法微波炉法制备胶体金，自制的大肠埃希菌O157：H7多克隆抗体包被胶体金制备探针，通过免疫渗滤法检测大肠埃希菌O157：H7。结果制备的胶体金颗粒均一、稳定性好，此法检测的灵敏度为3．1×10^6CFU／ml，特异性强，假阳性革为2．5％，检测时间只需3，5min。结论该方法简单、快速，无需特殊的仪器设备，适合现场检测之用。     

食品分析能力评估计划能力验证样品中大肠埃希氏菌O157:H7的分离鉴定及质量控制

目的从食品分析能力评估计划能力验证样品沙拉中分离、鉴定大肠埃希氏菌O157:H7,判断2份样品是否有检出。方法参照GB 4789.36-2016《食品安全国家标准食品微生物学大肠埃希氏菌O157:H7/NM》进行检测,将VITEK 2 compact生化结果符合的菌株进行O157和H7抗原血清学鉴定。结果样品编号M221d11B检出大肠埃希氏菌O157:H7,样品编号M221d11A未检出大肠埃希氏菌O157:H7。测试样品的背景干扰菌是成团泛菌和铜绿假单胞菌。结论取得满意的能力验证结果需要注意以下因素:培养基试剂的质量、样品之间的交叉污染、样品的正确复苏和制备、菌落特征的识别以及干扰菌株的排查等。     

快速检测大肠埃希菌O157∶H7免疫层析试纸条的研制

目的建立一种快速、特异性强、方法简便和经济实用的检测大肠埃希菌O157∶H7的免疫学方法。方法微波炉法制备胶体金,自制的大肠埃希菌O157∶H7多克隆抗体包被胶体金制备探针,通过免疫渗滤法检测大肠埃希菌O157∶H7。结果制备的胶体金颗粒均一、稳定性好,此法检测的灵敏度为3.1×106CFU/ml,特异性强,假阳性率为2.5%,检测时间只需3~5min。结论该方法简单、快速,无需特殊的仪器设备,适合现场检测之用。     

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒方法验证比对研究

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing,SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测食源性致病菌如志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM、阪崎肠杆菌的一致性。方法以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差异检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性:志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157∶H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157∶H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确度高的优点,无一例漏检。     

智舌检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7和金黄色葡萄球菌

目的:探究一种快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌的新方法。方法:基于多频大幅脉冲伏安法的智舌检测微生物生长过程中营养肉汤成分的综合信息,并结合主成分分析方法和簇类的独立软模式识别技术,对检测得到的数据进行分析。结果:在智舌的钯电极1 Hz频率段检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和1%葡萄糖营养肉汤区分效果较好,通过独立软模式识别技术能很好地判别、区分有菌生长的培养基和纯培养。结论:智舌能够有效检测、区分两种菌及培养基,有望成为检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌的一种新技术。     

濮阳市部分食品中3种致病菌污染状况调查

为掌握河南省部分食品污染物的污染情况,对濮阳市部分食品中的沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、O157:H7大肠埃希菌进行污染状况调查.共采样4类261份,检出3种致病菌27株,沙门菌11株(4.2%),单核细胞增生李斯特菌9株(3.4%),O157:H7大肠埃希菌7株(2.7%).生肉类污染最严重,检出率17.3%;其次为生食蔬菜,检出率14.5%;散装熟肉和生牛奶检出率较低,分别为4.3%和3.6%.11株沙门菌血清分型为:肠炎沙门菌6株,阿贡纳沙门菌3株,德比沙门菌2株.7株O157:H7均为肠出血性大肠埃希菌(EHEC).监测结果提示食品卫生工作者要提高对单增李斯特菌和O157:H77的认识,加强基层防疫站的监测能力,及时发现3种致病菌的血清型变迁和污染食品的种类变化,及时采取防治措施.     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。     

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的Taqman探针三重荧光PCR方法。方法 针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157：H7 的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果 引物与探针的最优浓度组合为：invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,三种微生物对应的能检出的最低菌体数量依次为：460CFU、76CFU、660CFU。结论 该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较

目的 以检测出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法 根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果 建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论 EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。     

荧光型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究基于荧光型重组酶聚合酶扩增(exo-RPA)技术原理,建立了一种大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。应用该方法对多种大肠埃希氏菌O157菌株和非大肠埃希氏菌O157菌株的检测结果表明,该方法的荧光探针和引物具有良好的特异性。对于梯度稀释的插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌0157的检测,大肠埃希氏菌O157 exo-RPA检测灵敏度分别可以达到10~2 copies/μL和2.1×10~4 cfu/mL。对食品样品中大肠埃希氏菌0157的检测,exo-RPA方法显示出了良好的稳定性。并且食品样品中目标菌经4 h增菌后,该方法的灵敏性可以满足对食品样品中初始浓度为2.1×10~1 cfu/mL的目标菌的检测。因为大肠埃希氏菌exo-RPA方法配套设备简便、廉价,所以该方法可以在各级检测机构中推广,并适用于食品生产到消费各环节中大肠埃希氏菌0157的即时检测。     

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。     

3种大肠埃希氏菌O157：H7筛检方法的比较

比较mini-VIDAS、膜芯片两种快速筛检方法和常规培养法,以确定两种快速筛检方法对大肠埃希氏菌O157:H7筛检的效果。以大肠埃希氏菌O157:H7为目标菌,针对3种方法设计灵敏性、特异性、抗干扰性试验和人工污染试验。结果表明,常规培养法和mini-VIDAS法的灵敏性较高,mini-VIDAS法和膜芯片法的特异性和抗干扰性较高,人工污染试验三者表现符合预期。日常检验中可采用国标法和mini-VIDAS法进行筛检工作,应急检验可使用膜芯片法缩短筛检时间,mini-VIDAS法和膜芯片法可作为初步筛检的工具使用。     

大肠埃希O157:H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制

目的:研制一种能够同时快速检测大肠埃希O157:H7、志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的三重PCR试剂盒.方法:以大肠埃希O157:H7的hlyAB基因、痢疾志贺氏菌的IpaH基因和致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因作为目的基因片段O157:H7、痢疾志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的特异性抗原基因序列,分别设计1对引物,并对其反应条件进行优化,建立1种多重PCR检测试剂盒.结果:本试剂盒可准确检测出生肉和即食肉制品中的上述3种致病菌,O157:H7检出极限为19.8 cfu/mL,志贺氏菌检出极限为17 cfu/mL,蜡样芽孢杆菌检出极限为17.7 cfu/mL.可在5 h内完成全部反应过程,得出检测结果.结论:本试剂盒在理论和实际应用方面均具有优越性,能够同时检测上述3种病原菌,可用于食品及其原料的生物安全检测,也可用于兽医临床诊断.     

致病菌快速检测管联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定即食食品中的大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立基于致病菌快速检测管技术联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)快速、高效、准确鉴定即时食品中大肠埃希氏菌(Escherichia coli, E. coli) O157:H7的方法。方法 选取改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptone soya broth, mTSB)为初筛培养基, 制作出针对即时食品中E. coli O157:H7的致病菌快速检测管, 初筛阳性结果采用MALDI-TOF MS技术鉴定。结果 5株常见E. coli O157:H7菌株均能特异检出, 而其他非E. coli O157:H7均未检出, 灵敏度可达51 CFU/mL; 通过对人工污染样品和自然样品检测, 鉴定结果和GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》方法完全一致, 且检测效率提高了30%。结论 两种技术联合应用建立的鉴定即时食品中E. coli O157:H7的新方法, 操作简便、成本低廉, 适合推广, 为快速、准确鉴定即时食品中E. coli O157:H7打开了新思路。