β-淀粉样蛋白的聚集及其调控

β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein,Aβ）的自发聚集形成大量毒性的寡聚体,导致脑内神经元死亡,从而引发认知障碍,即阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）,严重威胁着人类的健康。Aβ聚集过程呈现复杂的多尺度自组装特性,目前尚缺乏对Aβ聚集过程多尺度寡聚体的认识,严重制约Aβ聚集抑制剂的设计开发。本文首先简述Aβ聚集的基本理论以及与介尺度科学的关系,分类介绍Aβ自组装过程中所产生的各种介尺度寡聚体及其介导的细胞毒性;之后归纳各种Aβ聚集抑制剂的设计策略、作用原理和作用效果;最后总结Aβ聚集及其调控研究中存在的主要挑战,并提出了进一步研究的重点方向。     

阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白作用机制的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性病变,老年人是高发人群,严重影响老年人的健康及生活质量。AD患者脑内形成神经炎性淀粉斑,即老年斑(senile plaque,SP)是其病理特征之一,SP主要由细胞外的β淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)沉积而成。Aβ是一个具有β片层的二级结构多肽,由淀粉样前体蛋白(APP)经水解产生后在脑内聚集,引发相应的神经毒性,造成神经元死亡,从而导致AD的发生和发展。Aβ在AD发病过程中起着重要作用,但其具体作用机制尚未明确。本文就近年来对Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展作一综述。     

分子伴侣GroEL促进溶菌酶复性动力学

建立了溶菌酶复性的表观动力学模型 ,研究了分子伴侣GroEL促进变性溶菌酶复性的动力学行为 ,包括酶浓度、三磷酸腺苷 (ATP)浓度、GroEL与酶的摩尔比对复性率和复性速率常数的影响 .酶浓度对复性速率常数的影响比对复性率的影响显著 ;酶的复性率和复性速率常数随ATP浓度的增大而提高 ;在蛋白质浓度一定的情况下 ,存在适宜的GroEL和ATP浓度 ,使复性率和复性速率常数最大     

Aβ29-35在磷脂分子层上的构象变化及聚集的研究

β-淀粉样多肽(β-amyloid peptide,Aβ)在细胞膜上的错误折叠和聚集与阿尔茨海默病的发病机理有关,研究Aβ和细胞膜之间的相互作用对于我们深入了解Aβ的聚集和毒性机制是非常必要的。本文运用全原子分子动力学模拟的方法,研究了Aβ29-35在DPPG磷脂分子层上聚集的原子水平的详细信息。模拟结果表明,DPPG的存在诱导Aβ(29-35)的构象发生了较大程度的变化,在带负电的DPPG磷脂分子层上聚集。Aβ(29-35)在DPPG磷脂分子层上的聚集是肽链-肽链之间和肽链-DPPG之间相互作用的共同结果。     

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。     

β-呋喃果糖苷酶的抑制及其在低聚果糖生产中的应用

研究了复合抑制剂A、B对β-呋喃果糖苷酶(FFS)与β-果糖基转移酶(FTS)活性的影响.结果表明:复合抑制剂A在抑制β-呋喃果糖苷酶活力69.7%的同时,使β-果糖基转移酶活力提高到314.9%;复合抑制剂B则在使FFS活力降低51.5%的同时使FTS活力提高到386.9%.反应产物中有效成分低聚果糖(FOS)的含量从50%～55%提高到60%～63%,为改善低聚果糖产品质量、提高低聚果糖收率提供了可行途径.     

人工伴侣促进溶菌酶复性动力学

利用复性和聚集竞争反应动力学模型描述自发复性和人工伴侣系统(十六烷基三甲基溴化铵与b -环糊精)促进溶菌酶复性动力学。在酶浓度为0.5~2.0 mgmL-1、盐酸胍浓度为0.5~2.2molL-1范围内,系统分析了盐酸胍浓度和人工伴侣浓度对复性动力学的影响。与自发复性相似,人工伴侣促进溶菌酶复性亦符合3级聚集反应动力学。人工伴侣系统的主要作用是抑制聚集体的生成速率,从而达到提高复性收率的效果。在盐酸胍浓度小于1.2mol稬-1时,人工伴侣系统和盐酸胍对促进变性溶菌酶复性具有协同作用,两者共同作用对促进蛋白质复性具有显著效果。     

硫氧还蛋白相互作用蛋白上调对胰岛β细胞衰老的影响及其作用机制

目的探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)上调对胰岛β细胞衰老的影响及其可能的作用机制。方法采用慢病毒构建TXNIP过表达(Ad-TXNIP-GFP)及沉默(TXNIP-ShRNA)稳转INS-1胰岛β细胞株,Western blot检测衰老相关基因p16、p21、Rb、p38 MAPK磷酸化及p53蛋白表达水平。分别采用p38MAPK抑制剂SB203580、p53抑制剂Pifithrin-β预处理细胞后,Western blot检测上述蛋白的表达水平。结果 TXNIP过表达可促进p21、p16、Rb、p53蛋白表达、p38 MAPK的磷酸化(P 0. 01)及INS-1细胞衰老,TXNIP沉默可抑制p21、p16、Rb、p53蛋白表达、p38 MAPK的磷酸化(P 0. 05)及INS-1细胞衰老;p38 MAPK和p53抑制剂均可抑制p21、Rb蛋白的表达(P 0. 05),减轻细胞衰老;p38 MAPK抑制剂可抑制p53蛋白表达(P 0.05),而p53抑制剂并不影响p38 MAPK的磷酸化及p16蛋白的表达(P 0. 05)。结论 TXNIP可促进p38 MAPK磷酸化以及后续p16、p53蛋白表达上调,进而增加p21、Rb蛋白表达,从而引起INS-1细胞衰老。     

姜黄素及其修饰物对阿尔兹海默病作用机制的研究进展

阿尔兹海默病,老年痴呆最主要的类型,威胁老年人健康的"四大杀手"之一。全球每3秒新增一名阿尔兹海默病患者,到2050年,阿尔茨海默氏病(AD)将影响全世界约1.15亿人。AD与大脑中发现的老年斑和神经原纤维缠结中错误折叠和聚集的蛋白质(β-淀粉样蛋白和tau蛋白)积累有关。目前可用的AD药物只能暂时缓解症状,尚无有效的治疗方法。姜黄素作为拥有多途径、多靶点的复杂分子。其可以针对AD的多种病理机制、致病原因发生作用,姜黄素治疗AD的机制包括抑制Aβ形成,Aβ聚集和促进Aβ清除,抑制炎症,氧化应激和凋亡等,因而成为一种很有前景的治疗AD的多靶点新的生物活性药物。但由于其溶解度低,生物利用率差,不稳定等特点使其在临床应用中受到一定的限制。本研究旨在收集姜黄素及其修饰制剂在AD实验模型中的作用。     

GRP78肿瘤抑制剂的研究进展

葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是一种分子伴侣,属于HSP70家族,除了参与内质网应激状态下肿瘤的发生、发展与凋亡外,细胞表面的GRP78也可参与多种信号转导。GRP78抑制剂的研究正成为癌症治疗的热门领域,本文主要介绍了GRP78的结构及其抑制剂的最新进展。     

姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马组织中酵母自噬相关基因Beclin1表达和淀粉样蛋白生成的影响

目的观察姜黄素(curcumin)对APP/PS1(β-amyloid precursop protein/presenilin-1)双转基因阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)模型小鼠大脑海马组织中自噬相关基因Beclin1的表达以及淀粉样蛋白β(β-amyloid,Aβ)42生成的影响。方法将APP/PS1双转基因小鼠随机分为姜黄素高、低剂量模型组和空白对照组,每组10只,高、低剂量组分别将姜黄素按1 000和160 mg/kg加入饲料中喂养,连续给药6个月,空白对照组给予正常饲料,采用免疫组化和Western blot法检测姜黄素对小鼠大脑海马中Beclin1的表达和Aβ42生成的作用。结果与空白对照组相比,高、低剂量模型组小鼠大脑海马中Beclin1蛋白阳性细胞数及表达量均明显增多(P均<0.05),Beclin1蛋白的表达无剂量依赖性;Aβ42的生成随药物浓度的增加明显减少(P<0.05)。结论姜黄素可诱导APP/PS1双转基因小鼠大脑海马组织中Beclin1蛋白的表达,其机制可能是姜黄素通过促进自噬作用而抑制了Aβ42的生成,从而发挥其保护作用。     

多靶点抗Alzheimer病活性他克林-阿魏酸 缀合物的合成与活性研究

针对Alzheimer病多病因发病的特点,设计并合成了两种同时具有抗乙酰胆碱酯酶、抗Aβ_((1-42))蛋白氧化以及络合金属离子3种活性的抗Alzheimer病活性缀合物,其结构通过~1HNMR和MS确证。该化合物包含他克林、阿魏酸和氨基酸的结构,氨基酸连接在阿魏酸的羧基上以利于分子通过血脑屏障。活性测试表明,两种化合物都具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性和Aβ_((1-42))自聚集抑制活性。     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

两种因素对体外聚合β淀粉样蛋白寡聚体的影响

目的探讨β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)起始聚合浓度及PBS体系中添加SDS对Aβ寡聚体生成的影响。方法 Aβ_(40)、Aβ_(42)经六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol,HFIP)单体化处理后,分别溶于PBS及添加0.05%SDS的PBS中,Aβ样本250、125、62.5、31.2、15.6及7.8μmol/L梯度聚合,37℃恒温,100 r/min聚合72 h后,进行SDS-PAGE分析。结果 Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合的寡聚体生成量随着Aβ起始浓度的升高而增加。Aβ_(40)在无SDS制备条件下能生成大量二聚体、三聚体及少量十二聚体;SDS制备条件下生成二聚体及少量十二聚体。无SDS制备条件250、125及62.5μmol/L浓度的Aβ_(42)能生成三聚体及中、高相对分子质量的寡聚体弥散带;SDS制备条件250、125、62.5μmol/L浓度的Aβ_(42)可生成三聚体及中等相对分子质量的寡聚体,31.2μmol/L浓度的Aβ_(42)可生成低、中、高相对分子质量的寡聚体。结论适合的起始聚合浓度有利于Aβ_(40)、Aβ_(42)寡聚体的生成;PBS中添加0.05%SDS有利于生成稳定的Aβ_(42)寡聚体,但不利于Aβ_(40)寡聚体的生成。     

自发性高血压大鼠血脑屏障破坏与β-淀粉样蛋白积累的关系

目的探讨自发性高血压大鼠的血脑屏障破坏与β-淀粉样蛋白(Aβ)积累的关系。方法选取五只自发性高血压大鼠(SHRs)和五只血压正常的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠。采用免疫组织化学检查皮质中β淀粉样蛋白。从动态中对比增强磁共振成像获得的体积转移常数(Ktrans)用于评估体皮层的血脑屏障(BBB)通透性。结果与WKY大鼠(0.049±0.084min~(-1))相比,SHRs的WKY大鼠(0.299±0.063min~(-1),p0.001)显著增加。在SHRs的皮层中发现了Aβ积累,并局限于血脑屏障周围区域,而没有扩展皮质的其他实质区域。结论血脑屏障破坏与慢性自发性高血压老年大鼠大脑中的β淀粉样蛋白积累有关。     

糖原合成酶激酶-3β介导低氧诱导因子-1α抗心肌缺血/再灌注损伤的作用

目的通过稳定低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,探讨其是否通过糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤。方法将雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham组)、心肌缺血/再灌组(I/R组)、HIF-1α稳定剂二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxalyl glycine,DMOG)+心肌缺血/再灌注组(DMOG+I/R组)、HIF-1α抑制剂YC-1+I/R组(YC-1+I/R组)、DMOG+GSK-3β抑制剂SB216763+I/R组(DMOG+SB216763+I/R组)。各组进行相应处理后,处死大鼠并采集样本,Western blot法检测心肌组织中HIF-1α、总GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、UCP3蛋白表达量;Real-time PCR法检测心肌组织中VEGF、HO-1、Bcl2基因mRNA转录水平;HE染色法检测心肌损伤情况;免疫组化法检测心肌细胞炎性浸润情况;TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡情况。结果与I/R组相比,DMOG预处理组可上调I/R大鼠心肌组织中HIF-1α蛋白及其下游因子VEGF、HO-1、Bcl2 mRNA表达水平,并引起线粒体内膜UCP3蛋白及mRNA表达水平升高,同时明显上调p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达,并减轻心肌损伤、炎性细胞浸润及降低心肌细胞凋亡率(P <0. 05);与DMOG预处理组相比,给予GSK-3β抑制剂SB216763后,HIF-1α的心肌保护效应明显下降(P <0. 05)。结论 HIF-1α可减轻心肌缺血/再灌注损伤,其心脏保护作用应与GSK-3β的介导有关。     

肝X受体-β和三磷酸腺苷结合盒转运子A1在人脑胶质母细胞瘤中的表达和意义

目的研究肝X受体-β(Liver X receptor-β,LXR-β)和三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATP binding cassette transport protein A1,ABCA1)蛋白在人脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)中的表达及相关性,并探讨其对GBM的意义。方法分析48例GBM患者的资料,并取患者肿瘤组织石蜡切片,另取19份瘤旁正常脑组织石蜡切片为对照组,采用SP免疫组化法检测LXR-β和ABCA1蛋白的表达,并分析LXR-β与ABCA1表达的相关性。结果 LXR-β和ABCA1蛋白在GBM中的表达率分别为81.3%和77.1%,与对照组(15.8%和26.3%)相比,差异有统计学意义(P<0.001),且LXR-β与ABCA1的表达呈正相关(rs=0.500,P<0.05)。患者性别、年龄、胶质瘤复发、手术切除范围、肿瘤最大直径、术后放化疗情况与LXR-β、ABCA1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 LXR-β和ABCA1蛋白与GBM的形成和进展有一定关系,有可能成为临床诊断及治疗GBM的生物学指标。     

截短型神经连接蛋白-1原核表达载体的构建、表达、纯化及其对阿尔茨海默症的初步治疗效果

目的 克隆并构建5种截短型神经连接蛋白-1(tneuroligin-1,tNL-1)可溶性细胞外片段的原核表达载体,经表达、纯化后获得重组GST-tNL-1融合蛋白,初步探讨其对阿尔茨海默症（Alzheimer disease,AD）的治疗效果。方法 对神经连接蛋白-1(neuroligin-1,NL-1)的结构特征及理化性质进行生物信息学分析。利用NL-1细胞外片段设计5个截短片段（tNL-1(1)～(5)）,以NL-1细胞外片段1-691质粒为模板PCR扩增目的片段,构建pGEX-6P1-tNL-1原核表达载体,筛选最佳诱导条件后,表达重组tNL-1蛋白,经GST亲和层析法纯化重组蛋白。制备β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）寡聚体,并进行Western blot鉴定。将体外培养的人SHSY-5Y细胞随机分为3组：对照组（不加任何干预）、模型组（40μg/mL Aβ处理24 h）、实验组（Aβ与20、40、60μg/mL tNL-1(2)共处理24 h）,MTT法检测tNL-1(2)对Aβ诱导的SHSY-5Y细胞的保护作用。结果 NL-1有12个蛋白修饰位点,预...     

过表达脑红蛋白对水溶性β-淀粉样蛋白片段1-42诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤的保护作用及其机制

目的观察过表达脑红蛋白(neuroglobin,NGB)对水溶性β-淀粉样蛋白片段1-42(Amyloid-beta 1-42,Aβ_(1-42))诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤的保护作用,并探讨其机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,经Aβ_(1-42)预处理后转染质粒p EGFP-NGB及空载体p EGFP-N1,同时设空白对照组(未转染)。MTT法、流式细胞术及JC-1染色法分别检测过表达NGB对Aβ_(1-42)诱导损伤的SH-SY5Y细胞存活率、细胞凋亡及线粒体膜电位的影响,采用相应试剂盒检测细胞内半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)、caspase 9、ATP及细胞色素C(cytochrome C,cyto C)氧化酶活性;Western blot法检测细胞中cyto C、凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)、caspase 3及caspase 9蛋白的表达水平。结果过表达NGB可显著提高Aβ_(1-42)诱导损伤SH-SY5Y细胞的存活率(P0.001)及细胞中cyto C氧化酶、ATP的活性(P0.01);可显著抑制损伤细胞的凋亡(P0.05)、线粒体膜电位的降低(P0.001)及细胞中caspase 3、caspase 9的活性(P0.01);可明显降低损伤细胞内cyto C、Apaf-1、caspase 3及caspase 9蛋白的表达水平(P0.05)。结论 NGB可显著抑制Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤,促进其增殖,其机制可能与NGB恢复线粒体功能及抑制cyto C触发细胞凋亡密切相关。     

钙调神经磷酸酶对金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原活性的作用

目的探讨钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)发挥超抗原活性的作用。方法以终浓度为0.5、1、2、3和4μg/ml的重组野生型rSEC2及其增强型突变体蛋白mSEC2(T20L/G22E/H118A/H122A)刺激SD大鼠脾淋巴细胞,MTT法检测大鼠脾淋巴细胞增殖水平;检测终浓度为1μg/ml的rSEC2和mSEC2在诱导大鼠脾淋巴细胞增殖过程中CaN活性的变化、终浓度为0.1、0.5、1、2和3μg/ml的CaN特异性抑制剂环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)对该过程的影响,以及CaN3个亚基CaN Aα、CaN Aβ、CaN B在mRNA水平上的变化。结果在低浓度rSEC2和mSEC2刺激下,大鼠脾淋巴细胞增殖指数(proliferation index,PI)与给药浓度成正比,高浓度刺激下,可明显抑制大鼠脾淋巴细胞的增殖,1μg/ml浓度增殖效果最好;CsA对大鼠脾淋巴细胞增殖具有较强的抑制作用,呈明显的剂量依赖性,当CsA浓度为0.5～1μg/ml时,rSEC2和mSEC2的刺激作用即被完全抑制;CaN的活性及其相关亚基(CaN Aβ和CaN B)mRNA水平与其超抗原的刺激增殖活性具有明显相关性。结论 CaN对SEC2发挥超抗原活性具有重要作用,为提高SEC2的临床应用价值及规避毒副作用奠定了理论基础。