黑豆酯酶检测氧乐果残留条件的优化

目的研究以氧乐果为代表的有机磷农药残留检测条件。方法以黑豆酯酶为酶源,a-乙酸萘酯为底物,采用酶抑制法,考察黑豆酯酶稀释倍数、显色时间、反应温度3个因素对黑豆酯酶活力测定的影响。然后通过3因素3水平响应面法优化黑豆酯酶活力的测定条件,并确定氧乐果对黑豆酯酶的最佳抑制时间和检测的灵敏度。结果当黑豆酯酶稀释倍数为18,显色反应时间为10 min,反应温度为41℃时,黑豆酯酶活力测定的吸光度值达到0.811。氧乐果抑制黑豆酯酶的最佳时间是4 min。绘制氧乐果对黑豆酯酶的标准曲线,得到最低检测限为0.1μg/mL。结论本研究获得了以黑豆酯酶抑制法检测氧乐果残留的最佳条件,其检测限低于有机磷农药氧乐果残留检测的最低限值要求(0.2μg/mL)。因此,以黑豆酯酶为酶源的酶抑制法可以作为有机磷农药氧乐果残留快速检测的一种有效手段。     

基于MnO2纳米片类氧化酶特性的有机磷农药荧光分析方法建立

利用MnO2纳米片类氧化酶特性并结合有机磷农药的酶抑制原理,构建一种快速、简便、高灵敏有机磷农药荧光分析方法。通过测定反应体系荧光强度前后的变化,可以检测样品中有机磷农药的含量。通过优化酶浓度、底物浓度和反应时间,发现乙酰胆碱酯酶浓度为9.375 U/L,底物浓度为10 mmol/L,反应时间为11 min时,该荧光分析方法检测性能最佳,对氧磷的动态检测范围为1.56～200 ng/mL,检出限达到0.5 ng/mL（RSN=3）,运用该方法测定标准添加的自来水、卷心菜、燕麦样品的回收率在83.4%～105.9%之间,表明该方法具有很高的灵敏度与准确性,为快速高灵敏测定有机磷农药提供一种新的可能。     

基于rGO-AuNPS修饰丝网印刷电极的电化学生物传感器快速检测甲基对硫磷

目的：实现对甲基对硫磷的快速检测。方法：基于金纳米颗粒和还原氧化石墨烯制备了用于对甲基对硫磷进行定量检测的乙酰胆碱酯酶传感器。采用层层组装方法，将还原氧化石墨烯、金纳米颗粒、乙酰胆碱酯酶依次修饰在丝网印刷电极表面。对传感器的催化活性、阻抗特性、传感器的抑制率与甲基对硫磷浓度的关系、实际样品检测进行了评估。结果：制备的乙酰胆碱酯酶生物传感器对乙酰硫代胆碱氯化物表现出优异的亲和力，米氏常数为2.76 mmol/L。在最佳条件下，可以有效检测甲基对硫磷，线性范围为5～500 ng/mL，检出限为0.692 ng/mL。结论：该方法操作简单、成本低、稳定性好，适用于有机磷类农药的快速检测。     

适配体调控高SERS活性金纳米检测多菌灵

利用柠檬酸三钠还原氯金酸（HAuCl4）制备具有较高表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering,SERS）活性的金纳米（gold nanoparticles,AuNPs）溶胶作为基底,结合适配体与靶向物质特异性结合的性质,建立一个稳定性和重现性好的检测靶物质多菌灵（carbendazim,CBZ）的SERS定量检测方法。结果表明,在AuNPs浓度为6 mmol/L、NaCl浓度为15 mmol/L、维多利亚蓝B（Victoria blue B,VBB）浓度为0.25 mmol/L以及适配体溶液浓度为27 nmol/L的条件下,该法检出限为4.13 nmol/L,线性范围6.5 nmol/L～520 nmol/L,相关系数为0.998 8。     

基于脂质体反应器的酶纳米生物传感器在敌敌畏快速检测中的应用

采用脂质体技术制备乙酰胆碱酯酶的微反应器,并以微反应器、壳聚糖和二氧化硅为基质,构建以多层纳米酶膜修饰电极为核心的有机磷农药残留快速检测酶电化学生物传感器。结果表明,酶脂质体微反应器平均粒径为（7.26±0.75）μm;修饰电极多层酶膜的最佳层数为6 个双层;以敌敌畏作为有机磷农药模型,分别在其浓度为0.25～1.75 μmol/L和2.00～10.00 μmol/L线性范围内,传感器的峰电流值与乙酰胆碱酯酶抑制率呈现出良好的线性关系,回归方程分别为I=28.58C＋5.35和I=2.38C＋51.25;最低检出限为（0.72±0.065）μg/L（信噪比为3）;此新型酶纳米生物传感器具有良好的灵敏度、重复性和选择性。     

基于电沉积壳聚糖-碳酸钙-纳米金的有机磷农药生物传感器

目的 制备基于壳聚糖-碳酸钙-纳米金复合膜固定乙酰胆碱酯酶的新型电化学传感器。方法 一步电沉积壳聚糖、碳酸钙和纳米金修饰到玻碳电极, 由于电沉积过程有气泡产生, 使沉积到电极上的碳酸钙微粒形成了三维多孔的结构, 利于酶比较分散的固定在电极表面, 提高检测效率; 同时纳米金的引入不仅增大了电极比表面积, 而且促进电子的快速传递, 放大了检测信号。结果 将制备的生物传感器用来检测有机磷农药乐果, 检测限为2.5 pg/mL, 检测时间只需要7 min。结论 该生物传感器检测法实现了对有机磷农药快速、超灵敏的检测。     

微波辅助三乙醇胺还原法制备高SERS活性AuNF

采用微波辅助三乙醇胺还原法制备了表面高度分支化、具有较高表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)活性的金纳米花(gold nano-flower,AuNF)溶胶。利用透射电镜(trarsmission electron microscopy,TEM)表征AuNF的形貌与粒径大小,并以维多利亚蓝B(Victoria blue B,VBB)为探针分子测SERS光谱,结合金纳米花溶胶的紫外-可见吸收光谱、共振瑞利散射光谱,可判断微波20s条件下制备的AuNF溶胶其SERS活性最强。     

鲤鱼来源乙酰胆碱酯酶的高效表达及分子对接模拟

乙酰胆碱酯酶介导的农药残留检测方法在食品安全中发挥着越来越重要的作用。本研究以鲤鱼来源的乙酰胆碱酯酶基因(Cp ACh E)为试验材料,通过基因密码子优化来提高酶的表达量;通过表征鲤鱼乙酰胆碱酯酶的酶学性质探究其在农药残留检测中的应用潜力。采用计算机模拟技术寻找有机磷农药克百威与酶结合的氨基酸残基位点。结果表明:经密码子优化的重组酶乙酰胆碱酯酶的酶活力为7.4 U/m L,表达量提高约40倍,最适反应温度25℃,最适p H 8.0。动力学参数K_m和V_(max)分别是1.639 mg/m L和8.071μmol/min/mg。不同有机溶剂和金属离子对酶活力的影响存在差异,大多数有机试剂对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用,而Mg~(2+)、K~+、Ca~(2+)和Li~+离子对该酶活性有促进作用,其中Mg~(2+)(5 mmol/L)的促进最为明显,使该酶活力提高约1.7倍。重组酶对8种有机磷和8种氨基甲酸酯类农药都表现出较强的敏感性,其中,克百威抑制作用最强,最低检测限为0.044μg/m L。此外,分子对接发现,克百威与重组酶中的19个氨基酸之间形成氢键和疏水作用,其中氨基酸Tyr146、Ser147和Tyr355很可能是与克百威结合的靶位点。本研究成功实现了乙酰胆碱酯酶的高效表达,探究了乙酰胆碱酯酶与克百威的结合位点,为该酶在食品中有机磷和氨基甲酸类农药残留检测的应用及理性改造提供了一定的理论指导。     

聚硫堇修饰的有机磷农药生物传感器的研制

研制了一种用于蔬菜中有机磷农药残留快速检测的电化学酶传感器。通过循环伏安法将电子媒介体硫堇电聚合在玻碳电极上作为电子传递体,用壳聚糖凝胶将乙酰胆碱酯酶固定于聚硫堇电极表面,制成了新型的有机磷农药生物传感器。结果表明在有机磷农药乐果浓度为0.1~60μg/mL范围内,酶电极抑制率(%)与乐果的浓度(C)的对数呈良好的线性关系,相关系数为0.9961,检出限以抑制率10%的农药浓度计算为0.05μg/mL。     

酶催化光度法测定酒中微量甲醛的研究

研究了HCHO/NAD+/FDH体系的最佳条件,建立了简便测定甲醛的吸光光度法。实验发现:在温度为35℃、pH为7.0的条件下催化反应15min,所形成的催化反应产物在340nm处有最大吸收,甲醛含量在0.01452～0.2904μmol/mL范围内成良好线性关系,回归方程为:A=2.6604C-0.02476(C为μmol/mL),其测定相关系数为0.9998,检测限达0.0100μmol/mL(S/N=3),本法所用仪器简单、操作方便、选择性好,应用于酒中甲醛的测定结果令人满意。     

高表面增强拉曼散射活性rGO-AuNPs的合成及其在氧氟沙星检测中的应用

目的:为氧氟沙星含量检测提供新的研究方向。方法:利用生物质还原法合成具有高表面增强拉曼散射(SERS)活性的还原氧化石墨烯—金复合纳米材料(rGO-AuNPs),通过紫外可见光谱、透射电子显微镜、扫描电子显微镜证明rGO-AuNPs的成功合成，测量并计算其拉曼增强因子(EF)。基于SERS热点效应与核酸适配体的特异性结合能力建立OFL含量检测体系，优化检测条件，建立标准曲线，并将其应用于池塘水样OFL检测中。结果:以百合花瓣生物质成功合成了rGO-AuNPs,金纳米粒子生长在还原氧化石墨烯片层上，EF为3.88×10⁷。体系SERS强度与氧氟沙星质量浓度在1～500 ng/mL范围内有较好的线性关系，检测限为0.3 ng/mL。加标回收率为96.28%～102.84%,相对标准偏差<10%。结论:合成的rGO-AuNPs具有高SERS活性，在OFL检测方面具有较好的应用前景。     

小麦酯酶提取及其对有机磷农药检测初探

研究从小麦面粉提取小麦酯酶提取条件及其粗酶液对4种有机磷农药最低检测限和灵敏度。运用单因素实验和正交实验对小麦酯酶提取条件进行优化,确定适宜提取条件,提取液为0.15 mol/L NaCl溶液、料液比1∶4、40℃振荡提取60 min,提取粗酶液酶活为1.675 U/mL;并确定粗酶液对敌敌畏、敌百虫、乐果和毒死蜱等4种有机磷农药最低检测限分别为0.05 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg和0.07 mg/kg,均低于国家规定农药最大残留量,且粗酶液对敌敌畏灵敏度最佳。     

基于核酸适配体的微囊藻毒素LR纳米金生物传感检测方法的建立及其识别机制研究

目的建立微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)的纳米金生物传感比色检测法,并探究核酸适配体截短后对此方法检测效果的影响。方法采用柠檬酸钠还原法制备纳米金,通过优化盐浓度、适配体浓度、适配体与MC-LR的反应时间,建立了MC-LR的纳米金生物传感比色检测法。然后,采用组合型核酸适配体截短策略,探究了截短后的核酸适配体对比色法检测MC-LR的影响。结果 NaCl浓度为0.9mol/L,适配体浓度为0.4μmol/L, MC-LR与核酸适配体的反应时间为10 min时为其最适检测条件。在最适条件下,该方法的目测最低检测限为0.4μg/mL,仪器读数最低检测限为(1.05±0.002)ng/mL,线性检测范围为0～1.1μg/m L。探究得出核酸适配体截短后会影响其对MC-LR的识别活性。结论该方法简单、易行,线性检测范围宽,为小分子危害物核酸适配体的快速鉴定奠定了理论基础,同时,对截短核酸适配体与小分子危害物的识别活性研究提供了技术支撑。     

基于卟啉金属有机框架的荧光探针检测有机磷农药残留

目的 建立基于卟啉金属有机框架的荧光探针检测有机磷农药(organophosphorus pesticide, OPs)残留的方法。方法 以金属有机框架(PCN-224-Mn)的类氧化酶活性、硫代胆碱和邻苯二胺之间的竞争作用,以及OPs对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为基础,采用荧光法用于OPs残留的定量检测。结果 以毒死蜱为模型,所构建的探针在0.05～50.00μg/mL的线性范围内对有机磷具有灵敏响应,检出限为29.6ng/mL。茶叶样品中毒死蜱残留的加标回收实验得到回收率为103.00%～112.00%,相对标准偏差小于3%。结论 本研究不仅为精确、快速检测复杂样品中OPs残留提供了一种新的方法,而且为利用酶级联反应设计基于纳米酶的检测平台提供了新的见解。     

巨大芽孢杆菌产亚硝酸还原酶活性测定条件优化

为探明巨大芽胞杆菌产亚硝酸还原酶(nitrite reductase,NiR)的催化特性,更好发挥其催化性能,该文从缓冲液种类、电子供体种类及浓度、NaCl浓度、加酶量以及反应温度和反应时间等几个方面研究了巨大芽胞杆菌产亚硝酸盐还原酶活性测定的适宜条件.研究结果表明,该菌产NiR酶活测定体系为:在250μL反应体系中加入Na2HPO4(0.1mol/L)-柠檬酸(0.05mol/)缓冲液(pH6.0)125μL;1mol/L NaCl 15μL;0.05mol/L甲基紫精(MV)7.5μL、0.05mol/L硫代硫酸钠20μL和0.15mol/L连二亚硫酸钠20μL作为电子供体,加酶量50μL;优化后的反应条件为反应温度35℃,反应时间1.5min.     

固相萃取-高效液相色谱-柱后衍生荧光法测定奶粉中维生素B11含量

建立了固相萃取-高效液相色谱-柱后衍生荧光法用于测定奶粉中维生素B11含量。奶粉酶解样液经固相萃取小柱纯化后,在ZORBAX SB-C18色谱柱上,以pH=3.5、浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾-乙腈体系为流动相,流速为1.0mL/min,进样量20μL,以0.5%过硫酸钾溶液为衍生试剂,反应器温度为60℃,流速0.5mL/min,经荧光检测器(Ex=365nm,Em=440nm,增幅值100,衰减值16)检测定量。结果表明:在0.02～1.76μg/mL范围内该方法线性良好,R2=0.9999,检测限为4ng/mL,定量限为12ng/mL,灵敏度足以满足奶粉检测的需要,方法回收率在92.5%～95.7%之间,变异系数为1.32%。     

茶树叶绿体DNA的PCR-RFLP反应体系优化

通过正交设计对影响茶树聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应体系的主要因素进行优化,快速确立适合茶树叶绿体DNA PCR-RFLP分析的扩增体系和酶切体系。结果表明：最佳PCR扩增体系为100ng模板DNA、200μmol/L dNTPs、1.5mmol/L MgCl2、50ng叶绿体引物、3U TaqDNA聚合酶、加ddH2O至25μL;最佳酶切体系为6μL扩增产物用量、2U限制性内切酶量、1×限制性内切酶buffer、加ddH2O至15μL,37℃酶切6h。利用优化的反应体系,对30个茶树品种叶绿体DNA进行PCR-RFLP扩增,可获得清晰扩增图谱和多态性酶切图谱。     

正电性金纳米-核酸适配体纳米生物传感器快速检测野生菌中的α-鹅膏毒肽

目的 构建一种基于正电性金纳米-核酸适配体的纳米生物传感器,以实现野生菌中α-鹅膏毒肽(α-amanitin, α-AMA)的快速检测。方法 选择可与α-AMA特异性结合的核酸适配体作为识别元件,以半胱氨酸(cysteamine, Cys)修饰的正电性纳米金(gold nanoparticles, AuNPs)作为信号探针。基于静电吸附作用,将适配体固载到Cys@AuNPs表面。测定溶液在特定波长处吸光度值的变化,实现α-AMA的快速检测。结果 该纳米生物传感器检测α-AMA的最佳条件:Cys@AuNPs体积为150μL,适配体浓度为6 nmol/L, Cys@AuNPs与适配体反应时间为10min, α-AMA与适配体结合时间为10 min。在最佳条件下检测α-AMA的线性范围为1～125 ng/mL(r²=0.995)。本体系中α-AMA的检出限为0.87 ng/mL,加标回收率为98.6%～120.0%。结论 该纳米生物传感器操作简便、灵敏度高、特异性好、成本低廉,适用于野生菌样品中α-AMA的快速检测。     

基于纳米银颗粒团聚反应的表面增强拉曼光谱法测定牛奶中三聚氰胺的含量

建立表面增强拉曼(surface-enhanced raman scattering,SERS)技术检测牛奶中三聚氰胺含量的方法。以金属钛板作为SERS衬底材料,采用50 nm银纳米颗粒作为基底,控制银溶胶与样品的体积比为1∶2,Na Cl和Na OH溶液的浓度为4 mol/L,通过便携式拉曼光谱仪采集样品的SERS信号。在质量浓度0. 2～10 mg/L的范围内,SERS强度随着牛奶中三聚氰胺浓度的增大而增强,线性相关系数R~2=0. 998,检测限为0. 08 mg/L。使用银纳米基底对1 mg/L加标样品平行测定20次,三聚氰胺特征峰强度的相对标准偏差为4. 34%。此法简单易行,重现性好、稳定性高,可实现对牛奶中三聚氰胺含量的快速检测,为食品中污染物的SERS检测提供了参考价值。     

金纳米棒比色探针法测定维生素C的初步研究

目的采用金纳米棒作为探针,构建一套灵敏简单的用于检测维生素C的比色方法。方法采用壳聚糖-三聚磷酸钠复合物作为还原剂和稳定剂制备金纳米棒;采用紫外-可见光分光光度计和透射电子显微镜对其进行表征;根据金汞齐的形成原理,通过金纳米棒的长短径比值下降所造成的溶液颜色的明显变化,快速检测体系中不同浓度的维生素C。结果当检测体系中出现维生素C时,颜色由蓝色变为橙色;在维生素C浓度为1~100μmol/L和250—2000μmol/L范围内时,其浓度与体系吸光度比值(A_(530)/A_(640))呈现明显的线性关系,相关系数分别为0.9894和0.9843,检出限为0.067μmol/L。结论该体系下制备的金纳米比色探针可以实时快速检测维生素C的含量。