不同储藏年限稻谷真菌群落多样性与优势菌属探究

为有效防控储藏稻谷霉变,确保稻谷在储藏期的品质与安全,本研究先后对同一粮库点新入库、储藏1年、储藏2年及储藏3年稻谷样品进行了采集,并对其真菌群落多样性进行了探究.通过Illumina MiSeq序列分析法,探究了不同储藏年限稻谷的真菌群落多样性,优势菌属以及真菌群落随储藏年限增加的演变规律.结果发现新入库储藏稻谷的真...     

应用PCR-DGGE技术分析稻谷储藏过程中的真菌多样性

采用传统分离培养和基于18SrDNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法对新收获稻谷储藏期间的真菌多样性进行分析。结果表明,运用该法可以快速检出传统培养法不能检出的Rhodotorula mucilaginosa、Saccharomyces cerevisiae、Cryptococcus aureus、Phoma sp、Chaetosartorya cremea、Trichosporon caseorum等霉菌,且该法操作简便,为粮食霉菌的检测提供了一个高效、便捷的方法,同时极大地补充了储粮真菌的真菌库。     

高大平房仓稻谷粮层霉菌量与优势霉菌的差异性研究

采用传统培养法对湖南与湖北两省粮库中的稻谷进行研究,对高大平房仓粮仓上中下三层的稻谷霉菌量及优势霉菌进行研究。研究结果表明:湖南省储藏一年稻谷与新入库稻谷中层霉菌数分别为6.4×10~3 CFU/g、1.3×10~3 CFU/g,相比上、下层,中层最多;湖北省储藏一年稻谷下层霉菌数为1.4×10~4 CFU/g,相比上、中层,下层最多,湖北省新入库稻谷上层霉菌数为1.4×10~4 CFU/g,相比中、下层,上层最多。通过传统的菌落培养及菌丝、孢子观察,初步判断上中下三层的优势霉菌,并结合分子生物学的方法对其ITS序列进行分析,通过PCR扩增,将扩增出来的基因序列,在GenBank进行BLAST,最终鉴定优势菌株为黄曲霉、白曲霉、聚多曲霉、内生真菌、黑曲霉。     

基于内转录间隔区序列对云南12株鹅膏菌的分子分析

目的 基于内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列对云南省12株鹅膏菌进行分类鉴定。方法 采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide, CTAB)法提取12株鹅膏菌DNA, 以ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增, 完成DNA序列测序, 对序列进行分析并对发育树进行构建。 结果 12个样品的ITS序列长度574~755 bp, GC含量39%~47%, 平均遗传距离为0.329, YN05、YN03与其他10株鹅膏亲缘关系较远。结论 ITS序列高度保守, 在真菌的科属种上能够初步实现对物种的鉴定和系统 发育分析, 为建立云南省鹅膏属分子数据库提供基础数据。     

不同水分稻谷中真菌群落结构及多样性的差异分析

以不同水分含量的新收获东北早粳稻稻谷作为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序,分析二者真菌群落结构及多样性的差异,探究入仓储藏前不同水分稻谷真菌群落的原始状态。结果表明：根据97%的序列相似性水平,两种水分稻谷样品中的真菌群落共计属于2个门、26个纲、51个目、85个科、112个属、188个种。在门的水平上,两种水分的稻谷中真菌群落的优势菌门为子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota。在属的水平上,高水份稻谷中含量较高的为隐球菌属Cryptococcus 0.07%、Papiliotrema 3.81%,但在低水分稻谷中含量较低。通过Ven分析与PCA分析发现不同水分稻谷中尽管存在大量相同物种,但物种间丰富度存在差异,且高水分稻谷中存在的真菌菌种在种类和数量上要高于低水分稻谷。两组水分稻谷中具有显著差异的特征菌属如Filobasidium、Sarocladium、Mycosphaerella,对此可以通过降低稻谷水分来抑制其生长。综上,该研究对稻谷进入仓储前的水分控制提供了理论支撑。     

辽宁地区稻谷粮堆真菌分布及演替规律的研究

以东北地区辽宁省抚顺直属库高大平房仓储藏一年的稻谷为实验材料,研究平房仓内稻谷粮堆不同位置的温度、含水量变化对真菌种类分布及演替规律的影响。研究结果表明,稻谷低温条件储藏一年后,粮堆中各位点真菌数量均在10~3 CFU/g数量级以内,整仓稻谷储存安全。但由于稻谷粮堆不同深度温度和含水量的变化,稻谷真菌种类及数量会发生变化。稻谷在储藏期间,粮堆中层和下层平均温度低于10℃,优势菌为稻谷收获期间携带的田间真菌,低温有利于田间真菌孢子活性的保持;粮堆上层夏季平均温度达到20℃左右,含水量为14.5%左右,储藏真菌逐渐替代了稻谷收获时携带的田间真菌成为优势菌,高温是储藏真菌孢子萌发生长的主要原因。稻谷粮堆不同位置温度和含水量的变化,对稻谷真菌种类及生长有重要的影响,优势菌的演替可以用来表征粮堆局部微环境的变化。     

虫草属真菌的ITS序列分析和系统发育研究

收集不同产地虫草属真菌,进行ITS(Internal Transcribed Spacer)区段克隆测序和序列特征比较分析,并对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,并与检索获得的7个最相似物种的ITS序列构建系统发育树.结果表明,虫草属真菌的ITS序列长度为570～576bp,GC含量56.29～56.77%,系统发育分析显示,供试菌株中除C-6与九州虫草高度同源外,其他与蛹虫草均具有高度的亲缘关系.     

18S rDNA和ITS相结合鉴定一株盐生海芦笋内生真菌的研究

对分离自盐生海芦笋的一株代号为Salicorn 8的真菌进行鉴定,提取基因组DNA后分别PCR扩增18S rDNA和ITS区域,基因测序并进行同源性分析,构建ITS基因系统发育树,结合形态学分析,将该菌鉴定为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。     

三七中高产人参皂苷Rd真菌的鉴定

从云南文山三七根茎上分离得到具有转化人参皂苷活性的真菌。采用的方法是:利用平板划线分离法,从三七根茎中分离纯化得到2株真菌,用该菌株对三七进行液态发酵。通过HPLC检测,对发酵前后皂苷变化进行分析,对两株真菌进行形态显微鉴定及ITS序列分析。结果表明,菌株形态及显微特征和产孢结构与木霉属一致,利用ITS序列与相关类群构建聚类树,确定实验2菌株ITS总长度为550bp,与长枝木霉Trichodermalongibrachiatum Rifai株菌(ATCC18648T、ATCC208859、DAOM167674、DAOM231259)仅在全ITS第134位点上发生间或缺失突变,鉴定2株真菌均为长枝木霉T.longibrachiatum。HPLC分析显示,菌株能够将三七中量多的大极性皂苷转化为小极性皂苷,并高产人参皂苷Rd。结论由此可以证明长枝木霉具有转化三七中皂苷的活性。     

一株产几丁质酶渤海丝状真菌（Alternariatenuissima）的筛选及鉴定

以渤海湾水域获得的52株丝状海洋真菌为出发菌株,通过平板透明圈法和发酵液酶活性测定,从中筛选出一株产几丁质酶活力较高的海洋真菌mTJ04-1．1,结合形态学方法和18SrDNA．ITS序列分析对其进行鉴定,确定该菌为极细链格孢霉（AltemariatenuissimamTJ04-1-1）。该菌能在以几丁质为唯一碳源的平板上生长并产生明显透明圈,透明圈与菌落直径的比值（D／d）达N2．81。对发酵液几丁质酶活力分析结果表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为6．5,最适条件下酶活性可达3．2U／mL。     

北方储藏稻谷真菌多样性分析

本研究选择北方有代表性的地区,以高大平房仓常规储存的稻谷为研究对象,根据仓内储藏环境的差异进行分点分层取样。采用传统方法进行真菌分离纯化,通过形态学和分子系统学相结合进行菌株的分类鉴定,通过研究真菌分布为稻谷储藏过程监控提供一定的指导。结果表明,我国北方地区稻谷储藏期含水量为13.6%～15.6%,每个省储藏稻谷真菌菌落总数范围在10~3～10~4 CFU/g之间;北方储藏稻谷共分离出58种真菌,分布于2门,4纲,6目,13科,16属,主要优势菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillus amstelodami和多育曲霉Aspergillus proliferans被划分为灰绿曲霉群及其近缘类群,这类真菌对于仓储环境的适应性较强,可作为北方粮堆异常粮情早期监测预警的主要指示菌群;粮堆上层或靠近墙壁等易受环境温度影响的位置,易达到储藏真菌的生长条件,优势菌群由初始的田间和过渡真菌演替为储藏真菌,是高大平房仓稻谷储存过程中需要重点关注的位置。确定储藏稻谷的优势菌群及仓房重点关注位置,为北方稻谷储藏过程提供了技术参考。     

红茶菌中优势菌种的分离鉴定和发育树分析

目的:试验主要对红茶菌进行优势菌种的分离鉴定,并根据鉴定结果对其进行发育树分析。方法:将红茶菌原液进行分菌培养,得到的菌种进行纯化。对纯化后的单菌落进行扩大培养,提取DNA。分别采用16S r DNA和ITS进行基因扩增,细菌采用通用引物27F和1492R,真菌采用通用引物ITS1和ITS4进行扩增并对扩增产物进行BLAST分析。在数据库中对比基因相似度并通过Mega6.0分析,构建菌种发育树。结果:经过单菌落纯化,得到单一外表的醋酸菌和酵母菌。通过PCR扩增和凝胶电泳得出醋酸菌1500bp左右,酵母菌500bp左右。通过测序,将测序结果在BLAST中进行比对,将相似性基因通过Mega6.0分析,分别得到菌种发育树。结论:在生物学鉴定和系统发育树分析后,初步确定C1为醋酸杆菌Acetobacter sp.M1T5B1,1406bp。A1为异酒香酵母Brettanomyces anomalus,486bp。     

利用Illumina高通量测序技术筛选低温降解玉米秸秆真菌

玉米秸秆及根际土壤中纤维素降解菌资源丰富,本研究旨在分析其真菌群落结构及低温纤维素降解真菌的筛选。采集玉米秸秆及根际土壤,利用高通量测序方法对其中的真菌群落结构进行生物信息学分析,以羧甲基纤维素钠为唯一碳源,筛选低温纤维素降解真菌并通过ITS测序进行菌种鉴定。结果表明,对玉米秸秆及秸秆根部土壤测序共获得20715913 bp,共拼接成82250个基因片段,平均长度为249.29 bp,其中共发现5个真菌门,确定共有的优势菌属为Guehomyce;通过在15 ℃低温筛选、比较0、5、10、15 ℃低温下经刚果红染色产生的透明圈与菌落直径的比值得到3株产酶能力较强的纤维素降解真菌,分别为FB1、FB7、FB8。结合液态发酵测定其降解率分别是27.66%、21.53%、23.01%,最终确定菌株FB1分泌纤维素酶效果最好、降解效果最佳,经鉴定后确认为假枝孢菌(Cladosporium pseudocladosporioides)。     

基于形态特征和多基因序列鉴定储藏稻谷的优势真菌

稻谷储藏期间,真菌生长会影响稻谷质量,严重时会产生真菌毒素,引起食品安全问题。确定储藏期间稻谷的真菌群落组成并准确鉴定优势真菌,是实现有效防控危害真菌的前提,对于保障稻谷的品质和食品安全具有重要意义。基于此,利用传统的微生物分离培养方法,确定了不同地区粮仓内储存稻谷的真菌群落组成,并结合模式菌株和国际权威菌株序列,采用形态学观察及多基因联合系统发育分析方法准确鉴定我国储藏稻谷的优势种。结果表明,南方地区优势种为黄曲霉Aspergillus flavus、黑曲霉A. niger和蒙地曲霉A. montevidensis（阿姆斯特丹曲霉A. amstelodami）,北方地区优势种是多育曲霉Aspergillus proliferans和蒙地曲霉A. montevidensis。并阐述了南北方储藏稻谷主要优势种的详细鉴定过程及相关资料,为粮食中主要危害真菌物种的准确鉴定提供参考。     

多元线性分析在储粮真菌生长预测中应用研究

真菌生长是导致粮食储藏过程中粮食损失的重要因素之一,有效控制真菌生长对于保障储粮质量安全至关重要。储粮真菌生长受储藏环境等诸多因素影响,因此建立多因素条件下储粮真菌生长预测模型具有实际指导意义。本研究以稻谷为例,将不同水分梯度的稻谷样品,置于不同温度梯度恒温箱中模拟储藏180 d,定期取样检测真菌生长数量。选取静态模拟储藏检测的1 140组数据,利用MATLAB软件建立取对数后储粮真菌孢子数与稻谷含水量、储藏温度及储藏时间的多元线性回归模型,并对该回归模型进行F检验和t检验,通过残差分析消除异常数据优化模型,方程拟合优度R~2达到0.77。由回归模型可知,真菌生长数量与储藏温度、稻谷含水量和储藏时间呈指数关系,其中稻谷含水量影响最大,其次是储藏温度和储藏时间。结合华北地区粮库实仓检测数据对模型进行实仓初步验证,以储粮安全等级作为评价标准,储粮真菌危害程度预测的正确率达83.3%。通过多元线性回归方法得到的储粮真菌生长数量预测模型为实仓储粮安全状况预测提供了一个新的方法和途径。     

基于高通量测序分析储藏稻谷中的真菌群落结构与优势菌属

目的：探究不同环境条件下储藏稻谷中真菌多样性与真菌群落结构的变化。方法：以湖南衡阳仓储稻谷为研究对象,在不同温度（10、20、25、30、40?℃）和环境相对湿度（43%、75%和85%）条件下进行模拟储藏,然后利用Illumina HiSeq高通量测序技术分析原始稻谷与不同储藏条件下稻谷中真菌菌群结构与优势菌属。结果：基于可操作分类单元的物种分类分析,原始稻谷及在不同温度、湿度条件储藏后稻谷中的真菌群落共计属于6?个门、24?个纲、67?个目、160 个科、285?个属、406?个种。从门水平看,原始稻谷与储藏后的稻谷中子囊菌门（Ascomycetes）为优势菌门,相对丰度为2.53%～96.86%;其次为担子菌门（Basidiomycetes）,相对丰度为0.02%～9.39%。从属水平上看,稻谷中的优势菌属有白僵菌属（Beauveria）、Ophiosphaerella、曲霉属（Aspergillus）、赤霉属（Gibberella）、链格孢属（Alternaria）、暗球腔菌属（Phaeosphaeria）、黑孢属（Nigrospora）、微座孢属（Microdochium）和假丝酵母属（Candida）。从种水平上看,优势的菌种为球孢白僵菌（B. bassiana）、O. agrostidis、黄曲霉（A. flavus）、黑曲霉（A. niger）、赭曲霉（A. ochraceus）、错综赤霉（G. intricans）、链格孢霉（A. longissimi）、小孢暗球腔菌（P. microscopica）、黑孢霉（N. oryzae）。通过Venn分析与主成分分析,发现原始稻谷样品与不同温、湿度条件下储藏后的稻谷样品中真菌群落多样性存在较大差异,不同温、湿度条件中的稻谷样品真菌群落多样性之间也存在差异。结论：相对湿度是影响A. flavus相对丰度的最重要因素,当相对湿度为85%时,A. flavus相对丰度在各储藏条件中达到最大。综上所述,本研究对仓储稻谷的安全储存条件的优化提供了理论支撑。     

利用16S rDNA序列分析鉴定一株产抗菌物质的微生物菌株

从桃子上分离纯化得到1株产抗菌物质的菌株,命名为fmb3菌,通过抑菌实验发现该菌对革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌、革兰氏阴性菌大肠埃希菌和真菌扩展青霉等3种常见食品病原菌具有显著的抑菌效果。利用16SrDNA分析对该菌作了系统进化鉴定,首先提取fmb3菌基因组DNA,根据不同种属的细菌的16SrDNA序列两端的保守性设计通用引物,对fmb3菌16SrDNA片断进行PCR扩增,对扩增得到的目标片段测序,并且利用NCBIBLAST对测序结果进行比对,构建系统进化树进行分析,初步确定该菌属于枯草芽孢杆菌。     

基于高通量测序探究东北粳稻储藏期间真菌群落的演替

为探究不同初始水分的东北粳稻在模拟实仓环境储藏的条件下,稻谷中真菌群落随储藏时间的演替变化。选取水分在14.50%~15.50%的稻谷HW和13.50%~14.50%稻谷LW,进入模拟储藏实验。结果表明,在第一和第二储藏期高水分稻谷HW水分含量由15.50%降低至15.09%,低水分稻谷LW水分含量由14.21%降低至13.59%,直至第三储藏期保持平稳。基于可操作性分类单元（Operational Taxonmic Units,OTUs）的物种分类分析,两种水分的稻谷真菌群落经历了不同的演替变化。高水分稻谷在每个储藏期,真菌群落都发生了明显演替,稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、金黄色蝶形担孢酵母（Papiliotrema_aurea）、弯孢菌（Curvularia_inaequalis）、黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、汉纳酵母菌（Hannaella_sinensis）在储存结束时成为了最终的优势菌种。低水分稻谷在第二储藏期真菌群落发生明显演替,优势菌种为弯孢菌（Curvularia_inaequalis）、汉纳酵母菌（Hannaella_sinensis）、Hannaella_zeae。     

一株能产类胡萝卜素的粘性红酵母的分离与鉴定

通过YPD液体培养基富集培养和稀释涂YPD琼脂平板从苹果皮上分离一株产类胡萝卜素的酵母WP3。基于形态学,生理生化和18SrDNA,ITS区和26SrDNA D1/D2区序列分析确定这株酵母为粘性红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。     

应用纤维膜过滤方法从鱼肠内容物中分离到一株布氏弓形杆菌

目的建立弓形杆菌的分离培养方法。方法通过纤维滤膜过滤的方法对菌悬液过滤,用CCDA平板对弓形杆菌进行分离培养。将分离到的可疑菌落进行分纯培养,然后通过生化和16SrRNA序列分析进行鉴定。结果从鱼肠内容物中分离到一株疑似菌株,对其进行表型生化分析和16SrDNA全序列分析,鉴定该菌为布氏弓形杆菌。结论该检验方法适用于对弓形杆菌进行分离培养。