重组CD13单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4 细胞的靶向杀伤作用

目的: 本研究应用基因工程技术方法, 构建含重组编码CD₁₃单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide, AGAP) 融合蛋白基因的表达载体, 并研究CD₁₃-AGAP 融合蛋白对CD₁₃ 阳性白血病细胞NB4 影响。方法: 克隆东亚钳蝎活性肽AGAP 的基因, 插入真核表达载体pSecTag2 /CD₁₃ /RFP, 得到pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后, 脂质体介导重组质粒转染293T 细胞, 通过RT-PCR 和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白, 作用NB4 细胞, CCK8 检测细胞活性, 流式细胞仪检测细胞周期。结果: 酶切及测序结果证实pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP 重组真核表达载体构建成功, 转染293T 细胞后, RT-PCR 和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达, 并纯化真核表达融合蛋白CD₁₃-AGAP 对血液肿瘤CD₁₃阳性白血病细胞NB4 有一定的生长抑制作用, 并且使细胞周期G₁ 期阻滞, S 期减少。结论: 成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP, 并在293T 细胞中成功表达, 进一步证实融合蛋白对CD₁₃阳性白血病细胞NB4 有杀伤作用。     

Ca2+/CaM-CaN 途径参与神经肽Y 诱导的大鼠心肌细胞肥大

目的: 探讨Ca²⁺ CaM 依赖的钙调神经磷酸酶(CaN) 途径在神经肽Y(NPY) 诱导心肌细胞肥大中的作用。方法: 用NPY (10、100 nmol·L^-1) 刺激WISTAR 乳鼠心肌细胞, 并用CaN 特异性抑制剂环胞霉素A 加以干预。应用3H-Leu 掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率, 用免疫印迹(Western-blot) 和组织化学法分别测定心肌细胞内CaN-α蛋白表达和CaN 酶的活性。结果: 较高浓度NPY(100 nmol·L^-1) 可明显增加心肌细胞3H-Leu 掺入量(P < 0.05), 加入CsA 可阻断上述效应;NPY(100 nmol·L^-1) 还可明显增加心肌细胞内CaN 酶比活性(P <0.05), 并刺激心肌细胞CaN-α蛋白表达(P <0.05) 。结论: NPY 可活化大鼠心肌细胞Ca²⁺CaM-CaN 途径, 而CaN 特异性抑制剂环胞霉素A 可抑制NPY 诱导的心肌肥大, 说明Ca²⁺ CaM 依赖的钙调神经磷酸酶(CaN) 途径参与神经肽Y 诱导的心肌细胞肥大效应。     

Taxol对缺氧培养乳鼠心肌细胞Cx43蛋白表达及分布的影响

目的: 观察微管稳定剂Taxol对缺氧导致的培养乳鼠心肌细胞Cx43表达和分布的影响。方法: 差速贴壁梯度离心法分离培养乳大鼠心肌细胞,取培养 4 d 细胞缺氧 120 min,分别以不同浓度的Taxol干预;免疫印迹法检测聚合态微管蛋白含量、心肌细胞Cx43的蛋白表达,免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察Cx43的分布。结果: 正常培养心肌细胞Cx43分布在核膜和细胞的闰盘处,缺氧 120 min 可导致心肌细胞微管解聚,Cx43蛋白表达降低,在心肌细胞间连接处分布规律散失,核膜Cx43分布减弱或消失,而均匀分布在细胞膜上;在低剂量的Taxol作用下,心肌细胞微管解聚状态缓解,Cx43蛋白表达和分布异常明显改善;随着Taxol剂量增加,这种改善作用更明显,呈现剂量依赖性。结论: 缺氧引起乳鼠心肌细胞微管解聚,Cx43蛋白表达降低分布紊乱,微管稳定剂Taxol可以显著地保护缺氧导致的心肌Cx43异常,具有潜在的抗缺血性心律失常价值。     

H-2 Ag-TCS 连接物制备及抑制异种脾细胞增殖活性的研究*

目的 诱导特异性免疫无反应, 防止器官移植排斥反应。方法 供者(NIH 小鼠)主要组织相容性抗原(H-2 Ag)与天花粉毒素(TCS)经异型双功能试剂SPDP、2-IT 交联, 制备免疫毒素(AG^-TCS);AG^-TCS 预处理受者(SD 大鼠), 体外观察其脾细胞对供者抗原再刺激的反应。结果 受者脾细胞对供者抗原再刺激呈抑制状态, 而对非特异性刺激(PHA)呈增生活跃。结论 AG^-TCS 诱导的免疫无反应性具有供者特异性, 可用于器官移植免疫耐受的诱导。     

23-羟基白桦酸对阿霉素所致H9c2心肌细胞损伤的保护作用及抗氧化机制研究

目的: 基于细胞水平研究23-羟基白桦酸(23-HBA)对阿霉素(DOX)心肌损伤的保护作用并探讨其抗氧化机制。 方法: 采用H9c2心肌细胞,考察对照组、DOX组、23-HBA组及23-HBA联合DOX组给药后心肌细胞形态学变化,测定细胞体积及蛋白含量,Real time-PCR测定心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)的mRNA水平。考察心肌细胞内Caspase-3活性及Hoechst荧光染色后细胞核形态从而评价细胞凋亡水平。利用DCFH荧光探针测定细胞ROS水平,同时检测细胞内脂质过氧化物(MDA)生成量,评价细胞氧化损伤水平,寻找23-HBA心肌保护的可能机制。 结果: 5 μmol/L DOX诱导心肌细胞肥大,表现为细胞体积增大,蛋白含量增多,并显著上调细胞内ANP与BNP的mRNA水平,提高细胞内Caspase-3活性,导致细胞凋亡。23-HBA与DOX联合用药后,浓度依赖地降低DOX给药后心肌细胞内ROS水平,清除脂质过氧化物MDA,逆转DOX诱导的心肌肥大、心肌损伤标志物上调、心肌细胞凋亡等过程。 结论: 23-HBA可通过其抗氧化作用降低DOX所致的心肌损伤。     

川芎嗪对儿茶酚胺诱导大鼠心肌损伤时Bcl-2和Fas 蛋白表达的影响

目的: 观察川芎嗪对儿茶酚胺诱导大鼠心肌损伤时心肌细胞Bcl-2 和Fas 蛋白表达的影响。方法: 采用皮下多点注射异丙肾上腺素(ISO,5 mg·kg^-1) 每天1 次, 连续3 d, 诱导大鼠心肌损伤,采用免疫组化方法检测Bcl-2 和Fas 蛋白的水平, 并利用图像分析系统分析蛋白阳性表达区域平均光密度值。结果: 损伤组和川芎嗪保护组心肌细胞Bcl-2蛋白表达较对照组均显著升高(P<0.01), 损伤组Fas 蛋白水平较对照组也显著升高(P<0.01), 川芎嗪保护组的Fas 蛋白水平较损伤组显著下降(P<0.01), 且Bcl-2 Fas 比值也较损伤组和对照组明显增加。川芎嗪保护组的病理损伤程度明显低于损伤组。结论: 川芎嗪可抑制儿茶酚胺诱导的心肌损伤时心肌细胞中促凋亡基因Fas 的表达, 提高心肌细胞中Bcl-2 Fas 比值。     

中药有效成分Nordosin增强FK506体外抑制淋巴细胞IL-2分泌作用的研究

目的: 观察中药有效成分Nordosin对FK506体外抑制致炎细胞因子作用的影响,探讨Nordosin在移植免疫领域存在的潜在应用价值。方法: 建立ConA激活小鼠脾淋巴细胞增殖模型,采用ELISA和RT-PCR方法,测定Nordosin与FK506联合应用对淋巴细胞的IL-2蛋白和mRNA表达的影响;同时,运用流式细胞检测T淋巴细胞CD₂₅⁺表达的变化。结果: Nordosin与FK506联合用药可以抑制小鼠脾淋巴细胞的IL-2分泌(P<0.01),IL-2mRNA表达以及T淋巴细胞CD₂₅⁺表达也显著降低(P<0.01),其作用强于单独使用FK506组(P<0.01)。结论: Nordosin可以增强FK506抑制体外淋巴细胞IL-2分泌及其受体表达的作用,Nordosin可望成为一种免疫抑制辅助用药。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的: 构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12( HCV Core binding protein, HCBP12) 原核表达载体, 在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12 融合蛋白并制备兔抗HCBP12 多克隆抗体。方法: 应用逆转录聚合酶链反应( RT-PCR) , 以提取的HepG2 细胞mRNA 为模板, 扩增获得 HCBP12 基因片段, 插入至原核表达载体 pET-32a( +) 中, 构建原核表达载体pET-32a(+)-HCBP12, 转化大肠埃希菌BL21, 以异丙基硫代β-D-半乳糖苷( IPTG)诱导, 获得HCBP12 融合蛋白的可诱导性表达, 并通过SDS-PAGE 电泳、Western Blot 免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔, 获得抗HCBP12 多克隆抗体。以纯化HCBP12 为抗原, 利用 Western blot 和ELISA 法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果: HCBP12 融合蛋白表达成功。SDS-PAGE 分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12 多克隆抗体。ELISA 法表明多克隆抗体效价>1：512000, Western blot 检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论: 成功表达、纯化HCBP12 融合蛋白, 并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12 多克隆抗体, 为研究HCBP12 蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

低聚葡萄籽原花青素对异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大的影响

目的:在原代培养的新生大鼠心肌细胞上观察低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proanthocyanidins,GSP)对异丙肾上腺素(isoproterenol,Iso)诱导心肌细胞肥大的影响。方法: 采用SD大鼠乳鼠原代心肌细胞培养法,BCA法测定心肌细胞总蛋白含量;流式细胞仪检测心肌细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;比色法检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果: 1×10^-5 mol/L Iso能明显诱导心肌细胞肥大,GSP可剂量依赖性地抑制Iso诱导心肌细胞肥大,抑制细胞内ROS的生成,降低MDA含量、提高SOD活性。结论:GSP对Iso诱导的心肌细胞肥大具有明显的逆转作用, 其机制至少部分与抑制ROS生成、降低氧化应激水平有关。     

κ-阿片受体与β1-肾上腺素受体交互作用抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大

目的: 观察选择性 kappa 阿片受体(kappa opi-oid receptor,κ-OR)与 β 肾上腺素受体(β adrenergicreceptor, β-AR)在心肌细胞肥大方面的交互作用。方法: 以 体 外 培 养 的 乳 鼠 心 肌 细 胞 为 模 型, 10 μmol°L^-1 的异丙肾上腺素(β肾上腺素受体激动剂,β-AR)诱导心肌肥大, 观察 1μmol°L^-1的 U50,488H(κ-OR激动剂,U50)对其作用。进一步探索在100 nmol°L^-1ICI118, 551(β₂ -AR 阻断剂)存在情况下,κ-OR的激活对心肌肥大的作用。用 Lowry's 法测心肌细胞的蛋白质含量;用消化分离法,并利用计算机图象分析系统测心肌 细胞的体积;用[³H]leucine 掺入法测定心肌细胞蛋白的合成。结果: 异丙肾上腺素使心肌细胞总蛋白含量、体积、蛋白合成明显增加;1 μmol°L^-1 的 U50, 488H 使 ISO 诱导的心肌细胞总蛋白含量、体积、蛋白合成减少, 这种作用可被选择性 κ-OR阻断剂-nor-BNI(norbinaltorphimine)抑制。在 ICI118, 551 存在的情况下, U50 也能起到减弱 ISO 诱导心肌细胞肥大的作用。结论: U50,488H 通过激活 κ-OR 与β₁ -AR 交互作用抑制 ISO 所诱导的心肌细胞肥大。     

粘附分子CD54、CD44在苦瓜蛋白诱导K562 细胞凋亡中的作用

目的: 观察苦瓜蛋白诱导K562 细胞凋亡时细胞粘附分子(CD54 、CD44) 表达水平的变化,探讨粘附分子在苦瓜蛋白诱导K562 细胞凋亡中的作用。方法: 以一定浓度的苦瓜蛋白处理K562 细胞;CCK-8试剂盒检测其对细胞生长的影响;流式细细术(AnnexinⅤ) 、透射电镜等方法检测细胞凋亡;同时应用流式细细术检测粘附分子(CD54 、CD44) 蛋白表达水平的变化。结果: 苦瓜蛋白对K562 细胞生长具有明显的抑制作用;流式细胞术及形态学观察(电镜) 证实一定作用浓度的苦瓜蛋白可诱导K562 细胞发生明显的细胞凋亡;苦瓜蛋白处理组K562 细胞中CD54 、CD44表达分别为18.62 %和1.32 %,对照组分别为0.25 % 和0.17 %,分别上调了18.37 %、1.15 %。结论: 苦瓜蛋白引起K562 细胞凋亡的过程中,粘附分子CD54表达上调;CD54表达上调可能是苦瓜蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一,其机制可能涉及细胞粘附依赖性细胞凋亡。     

中国拟青霉对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的:研究中国拟青霉(CN-802) 对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及其对T 淋巴细胞亚群的影响。方法:小鼠尾静脉注射卡介苗加脂多糖(BCG+LPS) 建立免疫性肝损伤模型, 检测其肝、脾重量和转氨酶活性, 并同时测定血清与肝组织中脂质过氧化物(LPO) 含量及T 淋巴细胞亚群数量。结果:CN-802 连用10 d 后可减轻其增大的肝、脾重量指数, 降低小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT) 水平, 降低其血清与肝组织中LPO 含量, 并增加外周血中T 细胞亚群CD₄ 数量和CD₄/CD₈ 比值。结论:CN-802 对小鼠免疫性肝损伤模型有保护作用, 其作用可能与调节细胞免疫有关。     

阿司匹林、舒林酸对3AO细胞环氧合酶-2、血管生长因子、层粘蛋白受体、CD44V6表达的影响

目的: 研究阿司匹林、舒林酸对3AO 细胞环氧合酶-2(COX-2)、血管生长因子(VEGF)、CD₄₄V₆ 及层粘蛋白受体(LN-R)表达的影响。方法: 采用MTT方法观察阿司匹林、舒林酸在贴壁前后加入培养液中对3AO 细胞生长的影响。采用免疫细胞化学的方法研究两种药物对3AO 细胞COX-2、VEGF、CD₄₄V₆、LN-R 的影响。结果: MTT 实验显示阿司匹林、舒林酸不论在贴壁前还是后加入均可抑制3AO 卵巢癌细胞的生长,加药后调节pH 可减弱生长抑制作用但仍然可明显抑制肿瘤细胞的生长。阿司匹林和舒林酸对COX-2、VEGF 的表达也有抑制作用,但对CD₄₄V₆ 及LN-R 的表达无明显影响。结论: 抑制COX-2 的表达可以下调VEGF 的表达,从而抑制肿瘤的血管生成。阿司匹林和舒林酸可通过抑制COX-2 及VEGF 的表达而抑制肿瘤的生长。     

丹参注射液对小鼠心肌干细胞的影响

目的:探讨丹参注射液对小鼠原位心脏成体干细胞数量和旁分泌功能的影响。方法:以不同剂量丹参注射液对小鼠进行灌胃给药,分为高剂量丹参注射液组(5 g·kg^-1·d^-1)和低剂量丹参注射液组(0.5 g·kg^-1·d^-1),对照组采用相同体积生理盐水,每天1次连续1周。1周后经小鼠眼眶取血,检测血常规及肝肾功能;以小鼠新鲜心脏组织冰冻切片行免疫荧光染色,检测Sca-1⁺成体干细胞数量;以Real-Time PCR检测心脏血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6、BAD基因表达情况。结果:灌胃1周后,三组间血常规、肝肾功能差异无统计学意义(P>0.05);与高剂量丹参注射液组比较,低剂量丹参注射液及对照组中Sca-1⁺成体干细胞数量及VEGF和IL-6基因表达显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,丹参注射液高剂量组BAD基因表达较丹参注射液低剂量组和对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:丹参注射液能增多小鼠心脏中成体心脏干细胞数量,改善旁分泌功能。     

五甲基槲皮素预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的机制研究

目的: 探讨五甲基槲皮素(PMQ)预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其线粒体功能的影响。方法: 原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,经终浓度分别为10、30、100 μmol/L PMQ预处理 24 h 后,制作A/R损伤,检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、MTT法检测细胞存活率、流式细胞法检测线粒体膜电位和细胞凋亡情况、线粒体肿胀法检测各组心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)开放情况。结果: 不同剂量PMQ (10、30、100 μmol/L)预处理 24 h 后可剂量依赖性地降低LDH活性、增加细胞存活率、减少细胞凋亡(P<0.05 或P<0.01);30、100 μmol/L PMQ预处理 24 h 后,线粒体膜电位更为稳定、mPTP开放减少(P<0.05 或P<0.01)。结论: PMQ预处理 24 h 后,可产生药理性延迟保护作用,机制与其稳定线粒体膜电位、抑制mPTP开放,进而减少细胞凋亡有关。     

远端缺血再灌注预处理对心肌细胞膜ATP敏感性钾离子通道表达的影响

目的: 观察远端肢体缺血再灌注预处理后心肌细胞膜K_ATP通道在不同时点的表达变化。方法: 夹闭大鼠双侧股动脉 5 min 后开放 5 min,如此重复3次完成远端肢体缺血再灌注预处理,分别于处理后1、4、24和48 h处死大鼠,取其左心室肌组织,检测其心肌细胞膜K_ATP通道各亚基表达变化。结果: 远端肢体缺血再灌注预处理后,心肌细胞膜K_ATP通道的表达量增加,在4～24 h内增加最明显。结论: 远端肢体缺血再灌注预处理可上调心肌细胞膜K_ATP通道的表达,这种表达的改变可能参与了远端肢体缺血再灌注预处理对心脏的保护作用机制。     

纳米雄黄的抗小鼠原位乳腺癌作用及其机制

目的: 研究纳米雄黄体内体外对小鼠乳腺癌细胞(4T1)的增殖抑制作用及其机制。方法: 以萤火虫荧光素酶(Luciferase, Luc)基因标记小鼠4T1乳腺癌(4T1-Luc)细胞,应用噻唑蓝(MTT)比色法和生物发光法(Bioluminescent method, BLM)检测细胞增殖活性;细胞形态学及Annexin V/PI 双标记法观察细胞凋亡。4T1-Luc细胞接种雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫制作原位乳腺癌模型,纳米雄黄(4和 8 mg·kg^-1·d^-1)灌胃治疗 20 d,小动物活体成像系统连续动态观察小鼠乳腺肿瘤生长变化,治疗末期处死动物、剥离肿瘤块称重,并制片HE染色和CD₃₄标记观测肿瘤组织内细胞核分裂像、新生血管形成及坏死改变。结果: MTT法和BLM法检测显示 1.56~50 μg/mL 纳米雄黄体外显著抑制 4T1-Luc 细胞的增殖(P<0.05);形态学观察和Annexin V/PI染色显示细胞呈现典型的凋亡改变。体内纳米雄黄呈时间和剂量依赖性地抑制小鼠4T1-Luc原位乳腺癌的生长(P<0.05);肿瘤组织制片观察,经纳米雄黄治疗后肿瘤组织内细胞核分裂像和微小血管显著减少(P<0.01),肿瘤组织内部呈显著的坏死改变。结论: 纳米雄黄体外抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和诱导细胞凋亡,并主要通过减低原位肿瘤组织内新生血管的形成而导致肿瘤组织坏死而发挥抗乳腺癌作用。