恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。     

基于环介导等温扩增技术快速检测阪崎肠杆菌

为实现婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌快速检测,建立等温荧光扩增方法特异性检测阪崎肠杆菌。针对阪崎肠杆菌特异性保守ompA基因设计3套引物,通过引物筛选和反应体系优化,建立阪崎肠杆菌快速检测的实时荧光环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。以人工污染方式检验该方法在乳粉中阪崎肠杆菌检测灵敏度和稳定检测限,并对比实时荧光LAMP法和国标法在48份市售婴幼儿配方乳粉中的实际检测效果。结果显示,筛选ompA-2引物扩增效率最优,且与常见食源性致病菌无交叉反应;建立的实时荧光LAMP法对人工污染乳粉样品中的阪崎肠杆菌检测灵敏度、稳定检测限分别为10~2 cfu/g和10~3 cfu/g;48份市售乳粉样品进行增菌12 h,实时荧光LAMP法检测结果与传统国标培养结果一致。建立的实时荧光LAMP方法将为阪崎肠杆菌快速检测提供有力手段。     

交叉引物等温扩增检测霍乱弧菌方法的建立

建立食品中全血清型霍乱弧菌的交叉引物等温扩增检测方法。针对霍乱弧菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法,利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用57株霍乱弧菌及相近株细菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数、样品中添菌检测及与环介导等温扩增方法进行灵敏度验证及比较工作。结果表明,建立方法具有较好特异性;DNA检测灵敏度为79.28 fg/test,增菌液检测灵敏度为4.2×102CFU/m L,当每25克样品中有5.6 CFU菌时经增菌步骤后即可检出。建立的交叉引物恒温检测方法可作为食品中霍乱弧菌快速初筛检测方法使用,较环介导等温扩增方法灵敏且易于操作。     

LAMP法在阪崎肠杆菌快速检测中的应用

针对阪崎肠杆菌的ompA基因设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立一种快速检测阪崎肠杆菌的DNA环介导恒温扩增法(LAMP)。通过对2株阪崎肠杆菌标准菌株、24株阪崎肠杆菌分离株和18株非阪崎肠杆菌测试,结果表明此方法具有很高的特异性;对其灵敏度进行检验,发现该方法的最低检测限可以达到8CFU/mL,具有较好的敏感性。在1份实验室能力验证盲样和26份实际奶粉样品中应用发现,该方法与传统生化方法结果吻合,具有较好的可靠性。     

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

旨在建立针对阪崎肠杆菌的双重荧光PCR快速检测方法。以阪崎肠杆菌局部大分子合成(MMS)操纵子和外膜蛋白A(ompA)为靶基因,建立双重荧光PCR反应体系,探讨该体系的特异性、灵敏度和抗干扰能力。结果表明,双重荧光PCR体系对阪崎肠杆菌的灵敏度为4.3×103 CFU/mL,人工污染初始菌量为2 CFU/100 g奶粉样品增菌24 h即可检出;39株实验菌中的15株阪崎肠杆菌出现特异性扩增,24株非阪崎肠杆菌未出现特异性扩增。本研究所建立的双重荧光PCR体系特异好、灵敏度较高及抗干扰能力强,可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10~1cfu/mL,当每25g样品中有10~0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标一实时PCR技术研究

目的建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法。方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法。结果检测方法特异性强,无非特异性扩增;分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应;以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致。结论分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

应用核酸层析技术快速检测奶粉中阪崎肠杆菌的研究

结合PCP与胶体金免疫层析试纸条技术建立了核酸层析检测技术用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测.该技术根据寡-1,6-葡萄糖苷酶基因设计引物,并分别标记生物素和地高辛,通过试纸条上肉眼可见的红色条带对扩增结果进行判断.通过11株阪崎肠杆菌及27株常见致病菌的检测结果说明其特异性强,阪崎肠杆菌纯菌培养检测灵敏度达到103 mL-1,人工污染样品检测限达到0.08 g-1,检测奶粉样品时与传统方法(GB/T 4789.40-2010)相比,无显著性差异(x2=0,P＞0.05).该方法灵敏度高、快速、特异性强,可以很好地应用于奶粉以及其他食品中阪崎肠杆菌的检测与鉴定.     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法.以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物.优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法.结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍.人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101 cfu/mL.对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好.该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景.