用核糖体工程技术二次开发海洋微生物菌株资源的研究

经对无活性的海洋来源放线菌B3054进行链霉素抗性筛选,获得了一株具有抗肿瘤活性的链霉素抗性突变株SY-1.从该突变株的发酵物中分离得到了4个活性化合物,其中1个为新天然产物.对该菌株突变前后的rpsL基因(编码核糖体蛋白S12)进行分析未发现发生突变,提示突变位点可能在核糖体的另外亚基上.实验结果表明,核糖体工程技术可用于无活性菌株资源的二次开发利用.     

肺炎克雷伯杆菌优良菌株的选育

本文根据实例对肺炎克雷伯杆菌进行紫外诱变和硫酸二乙酯-超声波复合诱变处理,将诱变所得菌株进行耐甘油和耐1,3-PD驯化和选育,筛选得到两株高产1,3-PD的正向突变株,经发酵验证1,3-PD产量78g/L,较出发菌株提高了16.67%。     

赖氨酸发酵液侵染噬菌体快速检测与防治

噬菌体是发酵工业的头号杀手,发酵不同时期侵染噬菌体,对发酵的影响程度不一样,会造成减产、倒罐、甚至被迫停产。快速、准确的评估噬菌体的污染程度,对发酵具有非常重要的现实意义。本文通过查找资料和试验验证,确定发酵液侵染噬菌体的快速、有效的检测方法,及时采取措施对侵染液进行处理,减小污染程度,减少损失,以及采取有效措施进行防治,对大生产有切实可行的指导作用。     

从环丝氨酸抗性突变株中筛选α－淀粉酶高产菌株

以枯草杆菌ＢＦ－７６５８发出了菌株，采用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变，筛选Ｄ－环丝氨酸抗性株，逐步增加环丝氨酸浓度，从中得到α－淀粉酶高产菌株ＮＨ－５。采用往复式摇床和２Ｌ玻璃发酵罐进行发酵试验，ＮＨ－５菌株酶活较出发菌分别提高３０％和４８％。     

乳酸菌抗噬菌体侵染作用的研究

噬菌体是一类具有高度特异性的细胞传染因子,通常广泛滋生于各类环境中,由其侵染作用导致的发酵剂失效问题使食品行业损失巨大。为应对这一问题,该文整理了国内外有关乳酸菌抵抗噬菌体机制的最新研究成果,包括乳酸菌中的CRISPR-Cas防御机制及相变限制性修饰系统的作用方式,随后介绍了部分乳酸菌与噬菌体发生表面接触时的作用机理。最后,基于上述理论,该文整理了2种可以有效控制乳酸菌发酵过程中噬菌体污染的应对措施,以供参考。     

生物絮凝剂产生菌的N+注入诱变选育及其培养条件研究

为获得高絮凝活性菌株,采用低能氮离子诱变方法,对生物絮凝剂产生菌FJ-7进行诱变选育,筛选得到一株絮凝活性高、遗传稳定性良好的突变株NIM-192.发酵产絮凝剂曲线表明,其菌体生长速度稍慢于原始菌株,但絮凝活性一直高于原始菌株,絮凝率比原始菌株提高了34.26%.进一步研究表明,蔗糖、葡萄糖、半乳糖是NIM-192产生絮凝剂的适宜碳源,酵母膏:尿素为1:1的混合氮源为最佳氮源,培养基起始pH为7～9时,发酵液的絮凝效果最好.     

盐霉素高产菌的选育技术

根据盐霉素生物合成途径对其产生菌进行了推理选育。在常规诱变基础上选用丁酸作为筛选剂检出所需要的突变株,成功获得三株高产菌株3233#、3244#和3250#,其效价比出发菌株F21#分别提高了34％、44．9％和39％。     

高效降解苯胺的菌株AD9的分离、生理生化特性分析和分子鉴定

从活性污泥中分离到一株能以苯胺为唯一碳源、氮源生长的苯胺降解菌株AD9,该菌株最适生长的苯胺浓度为1000mg／L,降解效率可达90％,对苯胺耐受程度高达4500mg/L,降解苯胺的最适pH值为7．0,最适温度为30℃。以上实验结果表明,AD9具有降解苯胺速率快、耐受苯胺浓度高的特性。该菌具有氨苄青霉素、卡那霉素和利福平抗性,无氯霉素、四环素抗性,其16SrDNA序列与多株Delftia sp．菌有很高的同源性,其G＋C含量为66．8mol％,非常接近于标准菌株D．tsuruhatensis T7（66．2mol％）。另外该菌和17的DNA-DNA杂交率为83．8％。结合AD9的表型鉴定将该菌株归属为D．tsuruhatensisas。这是D．tsuruhatensis菌种苯胺降解细菌菌株的首次报道。     

浓醪酒精发酵菌种的选育

本文主要研究适合于浓醪发酵的酵母菌种的选育。以实验室自备的酵母菌为出发菌株,进行紫外线诱变处理和杂交处理,选育出产酒率高的菌株c紫外线诱变处理时-不改变紫外线照射波长和照射距离,通过照射时间的不同处理菌种,然后进行浓醪发酵试验,选育出适合于浓糖化醪发酵的高产酵母菌J-l-l-3:该菌株在料水比1:2的发酵液中,温度325±1℃,发酵85-96h的奈件下,产酒率达到14.1%(v/v)。     

D-核糖交联胶原膜的性质研究

根据关拉德反应(Maillard reaction)原理,以D-核糖为交联剂,氨水为pH调节剂,对胶原膜交联条件进行优化.对交联的胶原膜与未交联胶原膜进行XPS、IR、AFM、SEM表征,进一步考察了D-核糖与甲醛分别交联得到的胶原膜对I型胶原酶的耐受性.研究结果表明,在对酶的耐受性方面经D-核糖交联的胶原膜等同于甲醛交联的胶原膜.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运调控基因dctB的功能研究

为研究固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501四碳二羧酸转运相关基因dctB的生物学功能,构建了携带功能完整的dctB基因片段的广宿主质粒pLL2922,通过三亲接合将该质粒转移至dctB突变株及野生型菌株A1501,并对其以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基中的生长情况与固氮活性进行了测定。结果表明：dctB突变株不能利用琥珀酸和延胡索酸进行生长和固氮,但能以苹果酸为唯一碳源进行生长和固氮。携带功能完整dctB的广宿主质粒pLL2922,可以互补dctB位点的突变,并部分恢复突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力。将该质粒转入A1501野生型菌株可以提高A1501的固氮活性,在琥珀酸,延胡索酸,苹果酸为唯一碳源的培养基上固氮活性比野生型菌株提高62．8％,33．9％,27．8％。表明dctB基因对于四碳二羧酸的转运及固氮能力均具有重要作用。     

利用易错PCR随机突变技术突变EPSPs基因研究草甘膦抗性机理

运用易错PCR介导的随机突变技术使高抗草甘膦的菌株的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate,EPSPs)基因发生随机突变,转入EPSPs基因缺陷型的大肠杆菌ER2799中,通过互补试验获得对草甘膦抗性明显降低的突变株AZ100。测序结果发现AZ100的EPSPs基因与未突变基因相比,碱基序列发生了两个位点变化,第792位的碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T),第1203位的碱基由胞嘧啶(C)突变为鸟嘌呤(G)。氨基酸序列也发生了相应的变化,第264位由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val),第401位由丙氨酸(Ala)突变为甘氨酸(Gly)。二级结构预测显示此两个突变的氨基酸的位点恰好位于EPSPs与底物结合的关键部位。这两个氨基酸位点的突变,导致EPSPs在有草甘膦存在的情况下活性降低,从而导致菌株的草甘膦抗性降低。将这两个突变的碱基位点与美国的专利保护位点比较,发现这两个突变位点均不在专利保护范围之内。     

敲除Ras1基因对裂殖酵母生长及产孢影响

目的:探究Ras1基因对裂殖酵母生长及产孢的影响。方法:培养将野生型与基因敲除的突变株,分析其生长情况;野生型与突变菌株交配,探讨其产孢情况。结果:在25℃及37℃培养条件下,敲除基因后的突变菌株其生长慢于野生型菌株。产孢实验结果表明,野生型100%产生4个孢子,而突变菌株75%产生1个孢子、25%产生2个孢子,且突变菌株的孢子略小于野生型。结论:敲除基因Ras1会影响裂殖酵母的生长和产孢。     

化工新型材料

<正>新型酵母菌株可提高乙醇生产效率据报道,印度研究人员近日分离出一种新型酵母菌株,利用这种菌株发酵农作物秸秆等木质纤维素,可比传统菌株发酵多产生约15.5%的乙醇。据介绍,利用传统酵母菌株发酵水稻和小麦秸秆等木质纤维素生产乙醇,主要有以下瓶颈:需要将环境温度控制在30℃度以内,以确保发酵效果;酵母只对纤维素中部分成分有效,对其中的树胶醛醣等无效,不能充分利用;木质纤维素在预处理时会产生糠醛等抑制剂,降低发酵性能。     

利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株

本文旨在以海洋细菌Pseudomonas sp.QDA褐藻多糖(alginate)生物合成操纵元中的algG基因为靶点,利用DNA重组技术改建褐藻多糖的生物合成途径,以期获得产生甘露糖醛酸的突变菌株.首先,利用PCR克隆algG基因两侧大小分别为1.7kb和1.8kb的DNA片段作为同源片段,用编码Gm抗性的aacC1基因替换algG基因,构建成打靶载体pEX100TUDG.将打靶载体转入QDA,利用Gm抗生素和蔗糖为选择压力进行培养,通过PCR和Southern杂交验证,获得了突变菌株.1H-NMR、PAGE和GPC分析发现,突变菌株胞外产物为多聚甘露糖醛酸.该突变菌株的获得丰富了具有较高药物开发价值的甘露糖醛酸的来源,为褐藻多糖途径工程的进一步研究提供了理论依据和技术支持.     

噬菌体保鲜技术在预制菜中的应用研究进展

目的 综述噬菌体保鲜技术在预制菜中的应用研究，为预制菜的食品安全保障和噬菌体的应用研究提供依据。方法 本文以预制菜的食品安全为出发点，就预制菜进行分类，重点对动植物源食材的噬菌体生物防控的应用研究进行讨论。结果 分析表明，噬菌体在预制菜中的应用具有广泛的应用前景和价值。噬菌体可以有效地控制预制菜中的食源性细菌污染、保持食品品质并延长货架期。为提高噬菌体的抗菌效果，可以从噬菌体的浓度、稳定性及其与物理保鲜方法或生物、化学保鲜剂结合等方面考虑。结论 为实现噬菌体在预制菜中的广泛应用，还需提高噬菌体的筛选效率和稳定性，并制定相应的标准和规范，以提高消费者的可接受程度，促进噬菌体在国内市场的推广和应用。因此，使用噬菌体保鲜技术不仅能够延长预制菜的货架期、提高食品安全性，还能为食品行业带来更多的发展机遇。     

用核糖体工程技术开拓海洋微生物药用资源的研究

利用核糖体工程技术对海洋中无活性的放线菌B3054进行诱导,获得了突变菌株B3054／M,其形态、菌丝体颜色都与母体菌株有显著的差异,发酵液经HPLC分析发现,代谢产物有明显的变化,特别是突变株产生了能抑制小鼠乳腺癌tsFT210细胞周期活性的活性代谢产物。这是首次利用核糖体工程技术诱变得到的具有细胞周期抑制活性的海洋放线菌菌株,这一研究结果表明,利用该技术对自然界的无活性微生物进行诱导来拓展微生物药用资源是可行的。     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

抗牛精子sp18蛋白单链抗体基因的克隆及表达

应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗牛精子sp18蛋白的A5杂交瘤细胞系中分离总RNA,构建重组噬菌体抗体库。以牛精子作为包被抗原,经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”淘选后,用phage-ELISA筛选出特异性阳性克隆。取其中特异结合牛精子细胞的重组噬菌体抗体pCSA1克隆进行序列测定。将其ScFv(single chain fragment variable)因克隆到pET-30a( )上,用IPTG进行诱导表达,成功得到了抗sp18单链抗体基因蛋白。     

噬菌体ΦX174标准物质定值方法研究

采用国际标准ISO 16604中噬菌体ΦX174的双层琼脂计数方法作为噬菌体ΦX174标准物质定值方法,针对该方法进行了方法验证和协同实验验证以及不确定度分析。结果显示,该方法重复性和复现性均较好,室内重复性相对标准偏差为10.18%,室间相对标准偏差为14.58%。经统计分析,双层琼脂计数法相对扩展不确定度为12.44%,适用于噬菌体ΦX174标准物质的定值,对于人员防护装备防护性能评价具有重要意义。