烟叶蛋白高效降解菌的筛选鉴定及其作用效果研究

为有效降解烟叶中的蛋白质,改善烟叶的吸食品质,从河南、福建、云南3省的复烤烟叶表面筛选出18株具有降解蛋白质能力的菌株;通过测定菌株所产蛋白酶活性,筛选蛋白质高效降解菌株并进行16SrDNA测序,结合生理生化试验对其进行鉴定;进一步采用正交试验优化菌株在烟叶中的发酵条件,考察处理后烟叶的感官质量改善效果。结果表明:(1)HN-3为优选菌株,最大酶活达3 417 U/mL;(2)16SrDNA和生理生化试验证明,HN-3为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);(3)根据正交试验结果,将培养后的HN-3菌液按照3%的烟叶质量比例施加于抽梗后的烟叶表面,在温度为37℃的条件下发酵84h后,烟叶中蛋白质降解率可达29.66%;(4)评吸结果显示,发酵后的烟叶香气质变好,香气量、烟气浓度有所提高,杂气减少,余味有所改善,烟叶整体感官质量得到明显提升。     

枯草芽孢杆菌分离鉴定及其对烟叶化学成分和吸味品质的影响

为研究枯草芽孢杆菌对烟叶化学成分和吸味品质的影响,从初烤后烟叶中筛选出一株微生物（H11）,结合菌株形态和16S rDNA序列分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）;用H11对20 kg河南平顶山低等级烟叶（2017 DCFB）发酵30 h,对比分析发酵前后烟叶感官质量、常规化学成分、中性香味成分的变化,并采用宏基因组测序技术,分析了发酵前后烟叶表面微生物群落变化,探讨了酶在烟叶发酵中的作用。与发酵前相比,烟气透发性好、甜感增强、香气质提升、香气量增加;水溶性总糖和还原糖含量（质量分数）分别增加了2.52%和1.92%;（E）-β-大马酮、二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量（质量分数）分别增加了25.92%、10.57%和12.15%;烟叶表面微生物数量明显减少,芽孢杆菌属（Bacillus）微生物丰度增加至微生物总量的76%。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对烟叶化学成分和吸味品质有重要影响,且具有发酵时间短和处理量大等特点,可为微生物发酵低等级烟叶提供参考。      

浓香型大曲中产香微生物的筛选及鉴定

本研究从传统浓香型大曲微生物资源中筛选产香功能性微生物,研究其与大曲香味物质之间的联系,并对产香功能菌株进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离法从不同发酵阶段的浓香型大曲中分离纯化获得细菌22株,酵母6株。以小麦固体培养基为底物对各细菌、酵母菌株进行单菌产香实验,经闻香评价,菌株X19和J3发酵后能产生浓郁的香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这两株菌的发酵产物进行挥发性成分检测,发现菌株X19和J3的发酵产物中香味物质种类丰富,其中吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚等香味物质为浓香型大曲的重要香味成分。因此,可初步认定菌株X19和J3为浓香型大曲的产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,菌株X19为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),菌株J3为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。     

摩加夫芽孢杆菌产酶条件优化及对烟叶品质的影响

纤维素、果胶、淀粉和蛋白质是烟叶中含量较高的生物大分子，对烟叶品质的影响较为显著。本研究对烟叶醇化过程中的微生物进行筛选，并对其产酶条件和作用效果进行研究，旨在发掘对烟叶品质有促进效果的功能微生物资源。研究筛选得到2-4A菌株，能够同时分泌淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和蛋白酶，经鉴定为摩加夫芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。对2-4A菌株的发酵时间、发酵温度、培养基pH及接种量进行优化后，该菌株的淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的活力分别增加至41.36、3.64、5.14和72.13U/mL。用发酵液处理烟叶，能够对烟叶中的4种大分子物质进行降解，其中蛋白质的降解率达到37.8%，淀粉的降解率超过30%，果胶和纤维素的降解率均超过10%。经过2-4A菌株发酵液处理，烟叶中酮类、酸类、酯类、杂环类、醇类和醛类等香气物质的含量在整体上均得到提升，酸类和醇类物质提升最多。就单种致香物质而言，对烟叶香气有较大影响的茄尼酮含量比发酵前提高了0.51百分点，叶绿醇含量提高了15.83百分点，3-甲基丁酸含量提高了6.85百分点。摩加夫芽孢杆菌在协调烟叶化学组分和增加致香物质含量方面...     

陶融型酒醅中产香芽孢杆菌的筛选、鉴定及发酵产物分析

通过传统微生物分离法和纯种固态发酵产香试验,从陶融型酒醅微生物资源中分离、筛选产香能力优良的芽孢杆菌,采用形态观察、生理生化试验及分子生物技术对其进行鉴定,并对其耐受性进行研究。结果表明,从陶融型酒醅中共分离得到11株芽孢杆菌,其中,菌株YSB11产香较好,固态发酵产物中含有浓郁的焦香、糊香和酱香味,包含酚类、吡嗪类、呋喃类、芳香类、酯类等多种白酒中重要的呈香物质,为优良产香芽孢杆菌。菌株YSB11被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensiss）,可耐高温53 ℃、酒精度6%vol、NaCl含量8%及低pH值6.0。     

陶融型大曲中产香微生物的筛选及鉴定

本研究从陶融型大曲微生物资源中筛选产香功能性微生物,研究其与大曲香味物质之间的联系,并对产香功能菌株进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离法从不同发酵阶段的陶融型大曲中分离纯化获得细菌37株,酵母22株。以小麦固体培养基为底物对各菌株进行单菌产香实验,经闻香评定,菌株YSY04发酵后能产生浓郁的香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这该菌株的发酵产物进行挥发性成分检测,发现该菌株的发酵产物中香味物质种类丰富,其中吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚、2,3-丁二醇和萜烯类等香味物质为陶融型大曲的重要香味成分。因此,可初步认定菌株YSY04为陶融型大曲的产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,菌株YSY04为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。     

烟叶发酵过程中产木聚糖酶菌株的分离及鉴定

本文研究了微生物对烟叶增香的作用,研究结果对烟叶发酵有着重要意的义。在研究中用于筛选的烟叶样品选自三个年份（2007年、2008年、2009年）的五个产地（毕节、楚雄、昆明、曲靖、襄县）,即有15组样品。对烟叶样品依次进行微生物的富集、分离纯化实验,然后进行产木聚糖酶菌株的筛选,筛选培养基经刚果红染液染色之后,以菌落周围出现透明圈作为产木聚糖酶菌株的筛选标准。然后对筛选出的73株产酶菌株采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）进行木聚糖酶酶活力的测定,从中选择一株产酶活性较高的菌株-Qb4号菌株,进行形态学分析实验、生理生化实验、碳源利用分析实验以及16SrRNA保守序列分析,最终将该菌鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。将该菌应用于烟叶増香工艺流程中,是未来本课题研究的主要方向。     

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)筛选鉴定及在雪茄烟叶发酵中的应用研究

采用酪蛋白水解实验和蛋白酶活力测定对烟草表面微生物进行分离筛选,对所筛选菌株进行形态学观察、理化试验及16SrRNA基因测序的鉴定。将筛选所得菌株x-2添加到雪茄烟叶表面进行人工发酵,对发酵后烟叶进行常规氮化合物测定和感官质量评吸,结果表明:筛选所得菌株x-2在45℃时其产酸、中、碱性蛋白酶最高酶活力分别为91.63 U/mL、163.34 U/mL、43.82 U/mL,经过鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在雪茄烟叶堆积发酵过程中添加x-2可明显降低烟叶含氮化合物含量,发酵结束时烟叶总氮降低21.64%、蛋白质降低13.53%、总植物碱降低36.38%,挥发碱降低24.05%;感官评吸结果显示烟叶劲头、刺激性改善最为明显,同时杂气减轻、香气增加。     

TSNAs降解菌05-5402的筛选及其降解特性研究

为分离筛选能够降解TSNAs的微生物,探讨其降解特性,本研究采用替代底物平板稀释法分离和靶标底物点接法筛选相结合的分离筛选策略,筛选到能够利用NNK为唯一碳源和氮源而生长的细菌05-5402菌株,鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。白肋烟浸提液经05-5402菌株处理后,TSNAs含量降低了22.2%,其中NNK和NAT的含量分别降低了47.4%和55.7%。晾制的烟叶经05-5402菌株处理后,TSNAs降低17.3%,其中,NAB的含量降低了52.2%。发酵过程中的烟丝经05-5402菌株处理,TSNAs含量下降12.2%。05-5402菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解,具有较大的应用潜力。      

酱香型白酒发酵过程中微生物的功能研究

酱香型白酒高温制曲、高温堆积和高温发酵的条件,筛选和驯化了一些功能微生物,这些微生物的代谢产物形成了白酒风味物质的基础,所以研究微生物的功能性对酱香型白酒风味成分的解析和白酒品质的提高具有重要作用。在白酒发酵过程中,微生物有细菌、霉菌、酵母和少量放线菌。总结了近年来酱香型白酒酿造过程中功能微生物的研究,其中细菌主要研究芽孢杆菌耐高温、产酶、产香的功能性,其次对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌研究也较多,霉菌主要研究曲霉的产酶和耐受功能性,酵母主要研究产香和耐受性,且以假丝酵母研究较多,而放线菌研究很少。     

多菌灵降解菌的构建及对烟叶残留降解效果评价

为控制烟叶中多菌灵农药残留,利用降解酶基因质粒载体克隆技术,合成构建了对多菌灵具有较好降解效果的菌株MBC2019,并进一步筛选优化了其发酵条件和最佳浓度,研究了降解菌在烟叶种植、烘烤和打叶复烤阶段对烟叶多菌灵农药残留降解的效果。结果表明,降解菌的最佳培养温度为28℃,最适培养pH为7.0,最优接种浓度为3.00%。种植阶段,喷施多菌灵和降解菌后3~7d,未喷施降解菌烟叶中农药残留降解速度快于降解菌处理,14d后降解菌的促进效果开始显现,未使用降解菌的降解率为96.55%,使用降解菌的降解率提高到99.58%;在烘烤和打叶复烤阶段,未使用降解菌的烟叶中多菌灵降解较慢,120h降解率为8.07%和8.05%,喷施降解菌后,同期降解率分别达到77.97%和45.08%。因此该降解菌可用于烟叶种植,特别是烘烤和打叶复烤等阶段的多菌灵农药残留降解,具有良好的应用前景。     

烤烟复烤烟叶自然陈化过程中感官质量变化研究

跟踪鉴定14个烤烟复烤烟叶样品在自然陈化7～51个月期间感官质量变化情况。结果表明,(1)不同产区各部位复烤烟叶在济南自然陈化感官质量随时间变化情况不同:湖南和黑龙江上部、中部烟叶陈化23个月感官质量达到高峰;贵州、山东、云南、河南、巴西中部叶最佳陈化时间为34个月;贵州、山东、云南、河南和津巴布韦上部烟叶最佳陈化时间为34～39个月。(2)感官评吸总分与陈化时间符合二次曲线关系。(3)不同产区烟叶自然陈化期间烟叶质量变化幅度不同,以云南烟叶质量变化最大,贵州和黑龙江烟叶质量变化最小。云南、贵州烟叶经自然陈化效果较好。(4)上部烟叶比中部烟叶耐存放,河南烟叶和津巴布韦上部烟叶耐存放,云南烟叶不耐存放。(5)香气量指标变化较小,烟叶感官总体质量的提高主要由杂气、余味和香气质等指标变化引起。     

云南不同生态区烟叶主要品质性状差异分析

为掌握云南不同生态区烟叶主要品质性状差异，系统分析了滇东、滇中、滇西和滇西南生态区共计482个中部原烟样品外观质量、化学成分和感官质量间的差异以及烟气品质与化学成分相关性。结果表明，4个生态区中部烟叶的外观质量综合得分、烟碱、糖碱比、钾氯比无显著差异，滇东、滇西和滇西南生态区中部叶烟气品质综合得分无显著差异，烟叶清甜香和青香香韵均由滇中向滇东、滇西和滇西南逐渐减弱，劲头由滇东经滇中向滇西南逐渐增强。滇中烟叶的清甜香韵、香气质、香气量、余味以及烟气品质综合得分均极显著高于其他生态区；滇西南烟叶的木香香韵极显著高于滇西，钾含量和劲头显著高于滇东；滇西烟叶总糖含量极显著高于滇中，还原糖和钾含量极显著高于滇东和滇中，总氮含量极显著低于其他生态区。逐步回归分析表明，降低糖碱比值、提高氮碱比值将显著改善滇东、滇西生态区烟气综合品质。     

四个国家雪茄外包皮烟叶表面细菌分离与活性测定

研究不同国家雪茄外包皮烟叶表面细菌差异,并为筛选菌株在雪茄外包皮烟叶发酵中的利用奠定基础。利用常规分离方法对美国、巴西、多米尼加及中国4个国家的7个雪茄外包皮烟样表面细菌进行分离鉴定,并初步测定筛选细菌的功能活性。结果表明,4个不同国家雪茄外包皮烟叶表面共分离获得细菌100株;属水平上不同地区雪茄外包皮烟叶表面细菌多样性及数量存在差异,基本以芽孢杆菌和葡萄球菌为主,尤其芽孢杆菌属为优势菌属;细菌种类多米尼加 > 美国-2=中国-1 > 巴西-1 > 巴西-2 > 中国-2 > 美国-1。活性分析结果显示,具有纤维素酶、果胶酶和蛋白酶分泌功能的菌株分别为24株、20株和22株,耐烟碱菌株46株,有7株芽孢杆菌同时具有上述4种活性。本研究证明国内外不同地区雪茄外包皮烟叶表面细菌种类存在差异,以芽孢杆菌属为优势细菌,其次是葡萄球菌,且芽孢杆菌属酶活更全面,不同菌株间活性差异较大。     

烟草中淀粉降解菌的筛选、鉴定及发酵工艺优化

从河南初烤烟叶表面分离筛选得到一株淀粉降解菌HX-6,并对菌株产酶培养基和烟叶发酵工艺进行优化.结果表明:淀粉降解菌HX-6为枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis),其最佳产酶培养基配方为:可溶性淀粉与红薯淀粉(m可溶性淀粉:m红薯淀粉=1:1)17.0 g/L,蛋白胨与酵母粉(m蛋白胨:m酵母粉=1:1...     

烤烟霉变病原菌鉴定及其生防菌筛选

为明确云南省大理州烟叶烘烤变黄期叶柄和部分叶片霉变的病原菌,依据柯赫氏法则,采用组织分离法分离病原菌,经室内和烤房内验证致病性,结合形态学和多基因序列分析鉴定病原物种类,运用平板拮抗法和活体生测法筛选生防菌。结果表明,分离物的形态学与根霉属（Rhizopus sp.）真菌相似,其ITS序列与少根根霉菌（Rhizopus arrhizus.,异名Rhizopus oryzae）模式菌株CBS 112.07T序列一致性大于99%;基于内转录间隔区（ITS）、肌动蛋白（ACT）和翻译延伸因子1-α(TEF)的多基因序列系统发育分析也表明,病原菌与少根根霉菌亲缘关系最近。综合形态学和多基因序列分析结果,确定烤烟霉变病病原菌为少根根霉菌。通过平板对峙法筛选获得5株抑菌能力较强的拮抗菌,其中芽孢杆菌（Bacillus spp.）Z002和05-1205在烤房内的防治效果均在70%以上。     

一株胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa YG14的筛选及混菌发酵提高梗丝品质

基于产香及促进漆酶合成的特性,从烟梗中筛选获得一株产类胡萝卜素物质的胶红酵母YG14(Rhodotorula mucilaginosa YG14)。通过灵芝菌、胶红酵母YG14单菌和共培养混菌固态发酵梗丝,进行了细胞壁物质成分分析、梗丝中性致香成分检测及品吸质量评价。结果表明,筛选获得的胶红酵母YG14与灵芝菌共培养后,混菌固态发酵梗丝在细胞壁物质降解、中性致香成分质量分数和感官品吸等方面的改善比两株菌单独固态发酵梗丝效果显著增强。共培养混菌固态发酵结束后梗丝总细胞壁物质降解率达到37.20%;中性致香成分质量分数提升20.44%;感官品吸评价为甜感提升明显,木质气息改善明显,香气量有一定提升,灼烧刺激感改善明显,香气更显圆润。胶红酵母YG14与灵芝菌共培养后固态发酵梗丝能够显著改善梗丝的品质,增加梗丝在卷烟中的利用率。     

云南不同产地醇化雪茄烟叶微生物群落差异研究

为探讨云南不同产地醇化雪茄烟叶的微生物群落结构与国外优质雪茄烟叶的差异,以6个不同产地的7组雪茄烟叶为试验材料,采用高通量DNA测序技术,对烟叶样品中的细菌、真菌群落进行了微生物组学分析。结果显示,样本中细菌群落丰富度高于真菌。根据主要菌群丰度的相似性特征,能够对不同产地的样本进行聚类。在细菌方面,云南德宏、玉溪的烟叶与巴西烟叶群落结构最接近,其共有且相对丰度较高的主要菌属为Staphylococcus、Atopostipes、Corynebacterium、Pseudomonas及Brevibacterium。在真菌方面,同样是玉溪、德宏与巴西、多米尼加的样本最接近,它们之间共有且丰度较高的类群是Aspergillaceae科的1个属、Alternaria属、Aspergillus属、Wallemia属以及Cladosporium属等。这些微生物可能对降解烟草中的大分子有机物起到积极作用。     

湘南烟区烤烟内在质量量化分析与评价

为全面考察湘南烟区烤烟的质量区域特征及工业可用性状况,通过感官评吸和统计分析等方法,对湘南烟区10个烤烟主产县的186份烤烟样品的内在质量进行了量化分析与工业可用性评价。结果表明,湘南烤烟的配伍性和工业可用性较强,试验所选B2F、C3F、X2F 3个等级烟叶的内在质量绝大多数达到了一类烟的指标要求,其中,可作为高档主料烟、主料烟、辅料烟使用的比例分别为31.7%、38.1%和29.7%。烤烟内在质量评吸指标部位间差异极显著;品种间差异不显著;部分评吸指标年度间差异显著;县际间(除香气质外)差异不显著。     

基于16S rRNA基因测序分析烟叶发酵过程中表面微生物的多样性

雪茄烟叶经过发酵处理才能制成风味独特的雪茄产品,研究烟叶发酵过程中微生物的多样性对提高国产雪茄烟叶品质有重要意义。作者采集了来自云南省8个地区初步晾晒的雪茄烟叶和7种来自多米尼加共和国各地的优质雪茄烟叶,基于16S rRNA基因测序技术鉴定各个样品表面微生物种类,通过OTU聚类分析、Alpha多样性分析、物种组成分析等方法进行微生物多样性分析,获得晾晒烟叶表面的优势菌。结果显示,云南省雪茄烟叶的优势菌属为葡萄球菌属,其他常见菌属有假单胞菌属、无色杆菌属、棒状杆菌属、泛菌属等;多米尼加共和国雪茄样品中微生物物种分布较中国雪茄样品更均匀,微生物的多样性整体高于中国雪茄样品,其优势菌属多为葡萄球菌属、棒状杆菌属、四联球菌属;云南省临沧市雪茄烟叶优势菌属与多米尼加雪茄相似,而且它的物种多样性和均匀度高于中国其他地区,具有较大的发展潜力。