椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素的最新研究进展

在我国中北部地区,由椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒事件频有发生,中毒食物多为变质的发酵玉米面制品、长时间泡发的木耳和变质的银耳等。然而近年来南方地区相关中毒案例显著增长,广东传统河粉等米面淀粉制品存在被椰毒假单胞菌污染致人中毒死亡的风险,其毒素的致死率高,危害性强,受到全社会的高度关注。本综述总结了椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素米酵菌酸在理化、生化、检测技术、污染状况和影响因素的最新研究进展,并对鲜湿米粉中毒事件作出思考,为后续的相关研究提供理论基础。     

用单克隆抗体验证椰毒假单胞菌酵米面亚种O抗原型的初步研究

用椰毒假单胞菌种特异性Ｏ－Ⅰ因子及型特异性Ｏ－Ⅳ因子的单克隆抗体Ｐｃｏ６５和Ｐｃｏ１３对从中毒银耳、正常玉米面及动物饲料中新分离的９３株椰毒假单胞菌的菌体抗原型进行了验证。ＥＬＩＳＡ判定结果表明，除１株经再次生化验证鉴定为非椰毒假单胞菌呈阴性反应外，９２株菌均含有种特异性Ｏ－Ⅰ因子，阳性符合率为１００％，其中，４７株菌含有Ｏ－Ⅳ型特异因子，占总菌数的５１．０９％，比血清学分型率（４０．２３％）高出１０．８７％。研究结果表明，鉴定椰毒假单胞菌Ｏ抗原型时、联合应用种间和型间特异性单克隆抗体进行ＥＬＩＳＡ检测，可同时定种分型，方法灵敏、快速，重复性良好。     

椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒的病原分离鉴定

目的通过对食物中毒病原菌的分离鉴定,为查明中毒原因提供科学依据。方法分离鉴定和毒性试验按照国家标准方法 WS/T 12—1996《椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断标准及处理原则》和GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行。米酵菌酸检测按照GB/T 11675—2003《银耳卫生标准》执行,采用液相色谱-质谱联用法对样品开展检测。结果经VITEK 2 COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪进行鉴定,4份样品中3份鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌,小鼠毒性试验阳性。4份样品均检测出米酵菌酸。结论本次食物中毒源于食源性椰毒假单胞菌酵米面亚种污染。     

米和食用淀粉中椰毒假单胞菌酵米面亚种污染调查与风险分析

通过调查我国南方部分省份食品工业中常用的米和食用淀粉中唐菖蒲伯克霍尔德菌污染情况,首次在进口碎米中分离鉴定出椰毒假单胞菌酵米面亚种,预警潜在风险.本研究在曾发生过米酵菌酸中毒事件的南方省份采集了129份样品,其中大米47份、碎米18份和食用淀粉64份,分别按照GB/T 4789.29-2003和GB 5009.189-...     

椰毒假单胞菌酵米面亚种检测方法研究进展

近年来,由椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒事件常有发生,其毒素米酵菌酸的致病性极强,死亡率高,引起人们的高度关注。本文主要从国标法中的微生物培养技术、基因测序技术、PCR技术(包含常规PCR和实时荧光PCR技术)、环介导等温扩增技术及微滴数字PCR技术等方面总结椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测方法,并对该菌未来的研究方向进行展望。     

椰毒假单胞菌酵米面亚种脉冲场凝胶电泳分型的研究

目的建立椰毒假单胞菌酵米面亚种的脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型方法,并对29株分离株进行PFGE分型研究。方法分别选择5种限制性内切酶(XbaⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、SmaⅠ、AscⅠ)酶切椰毒假单胞菌酵米面亚种染色体DNA以进行PFGE分析,并利用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析。结果NotⅠ、SmaⅠ和AscⅠ的酶切片段过小,而XbaⅠ酶切片段的大小适中但数量过多,不能获得清晰可辨的图谱,均不适于椰毒假单胞菌酵米面亚种的PFGE分型。SpeⅠ酶切的PFGE条带数量和大小适中、指纹图谱清晰可辨,对椰毒假单胞菌酵米面亚种具有足够的分辨率。结论本研究建立的PFGE分型方法可应用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的分子分型和溯源。     

椰毒假单胞菌酵米面亚种灭活条件研究

目的：降低湿米粉中椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险,防止湿米粉米酵菌酸中毒事件发生。方法：采用加热和紫外的方法对椰毒假单胞菌酵米面亚种的灭活条件进行研究。结果：加热和紫外均可以杀灭椰毒假单胞菌酵米面亚种。结论：湿米粉企业可以使用加热或紫外的方法来防止产品被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染。     

一株椰毒假单胞菌酵米面亚种在培养基中的生长规律和产毒研究

目的：研究椰毒假单胞菌酵米面亚种在培养基中的生长规律和产毒情况,为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株特性研究提供参考。方法：接种不同初始菌液的马铃薯葡萄糖水(PD水),静置培养72 h,测定不同培养温度下的菌株和米酵菌酸浓度;接种同一浓度菌液的PD水,测定其不同培养方式下的米酵菌酸浓度。结果：静置培养后,低、中、高浓度菌液在4 ℃条件下72 h内未出现明显繁殖,但在26 ℃、36 ℃条件下培养出现明显繁殖,达到10⁸ CFU·mL^-1数量级后趋于平稳;4 ℃条件下的低、中、高浓度菌液和26 ℃的低、中浓度菌液培养物中均未检出米酵菌酸,26 ℃培养条件下的高浓度菌液培养物中检出的米酵菌酸浓度较低,为5.48～6.72 μg·kg^-1。而36 ℃条件下的3个浓度菌液培养物中的米酵菌酸持续升高,但都低于400 μg·kg^-1。接种了10⁸ CFU·mL^-1菌液的PD水采用静置、振荡培养后,米酵菌酸浓度振荡培养>静置培养。结论：椰毒假单胞菌酵米面亚种在PD水中培养...     

椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉及其原料中的生长产毒规律及风险分析

采用在湿米粉及其原料米和米浆中分别接入不同浓度（103、105和107 cfu/mL）椰毒假单胞菌酵米面亚种（简称“椰毒假单胞菌”）,在最佳产毒温度（26 ℃）和最佳生长温度（36 ℃）中培养并检测毒素米酵菌酸含量变化等技术,研究分析了椰毒假单胞菌在三种食物基质中的生长产毒规律以及相关风险。结果表明：椰毒假单胞菌产米酵菌酸的量与食物基质中椰毒假单胞菌量呈正相关,与食物性状、含水量等有较大相关性;相同接菌量、培养温度和时间下,湿米粉中米酵菌酸含量高于原料米和米浆（最高约5000多倍）;湿米粉和原料米分别接菌105 cfu/mL、26 ℃和36 ℃培养,培养48 h时湿米粉中米酵菌酸含量可高达27 mg/kg,风险较高,原料米培养期间（35 d）米酵菌酸含量约在0.7~16 µg/kg,风险较低。研究提示应从原料、生产、储运、经营和消费全链条来加强防控湿米粉被椰毒假单胞菌污染产毒。     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR方法的建立

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法.方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立了实时荧光...     

椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性分型方法的建立

目的 建立椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)分型方法,并对4株模式菌株和19株分离菌株进行分型.方法 选用4种低频限制性内切酶(ApaⅠ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和PstⅠ)和2种高频限制性内切酶(Mse Ⅰ和Taq Ⅰ)进行组合,对FAFLP预扩增和选择性扩增体系进行优化,用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析,并与VITEK 2 GN生化结果和16S rDNA序列分析进行比较.结果 Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为7个群,菌株间最低相似度为80.85％,最高相似度为98.77％.PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为10个群,菌株间最低相似度为48.68％,最高相似度为99.67％.两种FAFLP组合均能将菌株进行完全区分,而VITEK 2 GN和16S rDNA序列分析无法将菌株进行完全区分.结论 ApaⅠ-G/Taq Ⅰ-G组合与PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合FAFLP对椰毒假单胞菌酵米面亚种具有足够的分辨率,本研究建立的FAFLP分型方法可应用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的分子分型和溯源.     

椰毒假单胞菌酵米面亚种选择性分离培养基的比较研究

目的比较4种椰毒假单胞酵米面亚种选择性分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂,PDA;改良马铃薯葡萄糖琼脂,mPDA;椰毒假单胞菌酵米面亚种分离琼脂,PCFA;银耳卵黄氯霉素琼脂,TYCA)的分离效果,为修订GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》提供技术支持。方法接种椰毒假单胞菌酵米面亚种于4种选择性分离培养基,观察各培养基上目标菌菌落形态,计算生长率;接种10种常见致病菌和环境中常见菌于4种选择性分离培养基,进行生长特异性试验;通过直接涂布和增菌划线的加标试验,验证这4种选择性分离培养基对粪便、食品和环境土壤等不同标本/样品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的分离检出情况。结果 mPDA和PCFA能够分别抑制8种和6种致病菌的生长,且椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长率都高于75%;在mPDA和PCFA上,目标菌与多数杂菌形态有明显区别,而在PDA和TYCA上,形态相近不易区分;在粪便、土壤和食品等不同标本/样品的直接涂布和增菌划线分离的加标试验中,mPDA和PCFA上的检出率均超过80%,明显高于PDA和TYCA。结论 mPDA和PCFA分离效果比原标准的PDA明显提高,建议在标准修订中增加此两种选择性分离培养基。     

湿粉生产中浸洗米工艺去除椰毒假单胞菌酵米面亚种污染分析

研究湿粉(湿米粉及淀粉制品)加工过程中浸泡和洗米工艺对椰毒假单胞菌酵米面亚种的清除作用.模拟米样品污染椰毒假单胞菌酵米面亚种,36℃培养72 h后,在米表面形成菌膜,再模拟目前湿粉生产过程中浸泡和洗米工艺方式(静态浸泡清洗和动态缓慢搅拌清洗)进行处理,联合采用微生物检测技术、动物毒力测试和液相色谱-质谱/质谱检测技术,...     

2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的调查分析

目的 调查分析2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种。方法 在广东省中选取粉丝粉条、河粉米粉等米面制品、淀粉及其制品的企业、超市、农贸市场及餐饮单位为采样点, 随机抽取1570份样品按照GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行检验和VITEK2鉴定。结果 1570份样品中5份检出唐菖蒲伯克霍尔德菌, 其中只有1份检出椰毒假单胞菌酵米面亚种, 检出率为0.06%(1/1570)。结论 米面制品、淀粉及其制品中检出唐菖蒲伯克霍尔德菌, 表明广东省米面制品、淀粉及其制品中存在被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险。为最大限度降低或消除风险隐患, 相关部门应加强安全监管, 保障人民群众身体健康和饮食安全。     

实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米

应用实时荧光PCR技术对转基因大米进行了定性和定量检测研究.本研究以转基因B163大米为材料,采用TaqMan探针技术,对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthndngiemis,简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因Cry1Ac进行了实时荧光PCR研究,并对外源基因Cry1Ac进行了定量检测和敏感性分析.该实时荧光PCR方法检测结果和常规PCR结果一致,同时不用进行凝胶电泳,更为快速、简便,降低了污染机会,可用于转Bt基因大米的定性和定量检测.