EIAV强毒株和疫苗株gp45的纯化及结晶比较

EIAV（equine infectious anemia virus）疫苗是世界唯一成功的慢病毒疫苗．通过对强毒株和疫苗株EIAv相关蛋白结构的比较研究,可以促进对其致弱过程及免疫机制的了解．gp45（glycoprotein 45）是EIAV介导与宿主膜融合过程的关键蛋白．以EIAV强毒株LN40和疫苗株FDDV13为研究对象,对gp45核心结构域进行了克隆、表达,并时纯化和晶体生长进行了比较,为进一步的三维结构解析,更好地理解EIAV减毒疫苗的免疫机制及相关疫苗设计奠定了基础．     

发菜中糖基转移酶基因的克隆及原核表达

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生蓝藻,前期转录组测序发现糖基转移酶基因转录水平较正常上调2.29倍.以发菜基因组为模板克隆糖基转移酶基因,获得长度为1 290bp的核酸序列.通过生物信息学分析表明,通过生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋,是亲水性蛋白,酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点个数分别为2、9、18,蛋白质分子量为47.54kDa,等电点为9.33.正负电荷氨基酸残基数分别为61和51.随后,将该基因插入质粒pET-28a中成功构建重组表达质粒,然后转化至BL21大肠杆菌感受态中进行原核表达.在OD值为0.8时,用1mM IPTG在16℃下诱导表达20h后,获得预期大小重组蛋白(47.54kDa).研究首次成功克隆得到发菜糖基转移酶基因,并构建重组质粒于大肠杆菌中高效表达,实验结果为进一步研究发菜多糖代谢分子调控机制奠定了基础,也为今后糖基转移酶基因工程菌株的构建提供理论依据.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

仿刺参溶菌酶在重组酿酒酵母中的表达

采用酿酒酵母MKP-0表达仿刺参溶菌酶蛋白(AjLys)。以质粒pMD18-AjLys为模板,PCR扩增将组氨酸标签His-tag克隆到AjLys基因的N末端,构建克隆载体pMD18-His6-AjLys。根据密码子偏好性,通过定点突变对AjLys蛋白第69、77和95位的3个精氨酸的密码子进行优化,得到克隆载体pMD18-His6-AjLys(Δ69,77,95)。经SpeⅠ/BglⅡ酶切,构建重组表达质粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)。基因工程菌pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)/MKP-0通过半乳糖诱导72h后,Western Blot检测结果表明其成功表达了AjLys蛋白。抑菌实验结果表明,AjLys蛋白对溶壁微球菌具有一定的抑制作用。本实验成功构建了AjLys的酿酒酵母表达载体,并可在MKP-0细胞中表达了具有活性的AjLys蛋白,为AjLys的生产提供了一种具有可行性的新方法。     

罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的生物信息学分析

综合利用多种生物信息学工具对罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因及其启动子区进行了定位,分析了4种乳酸菌亚油酸异构酶基因的上游调控区,发现了主要保守位点.分析证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶具有2个二硫键,1个糖基化位点,多个磷酸化位点,无信号肽序列,但在25(26)~42位存在跨膜区.证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的密码子偏好性与大肠杆菌和酿酒酵母的密码子偏好性存在差异,初步分析了该基因在这些宿主菌中表达时可能存在的问题,并提出了改造方案.     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.     

妥布霉素糖基转移酶基因tobM2的研究

为探索妥布霉素生物合成过程中糖基转移的作用,对糖基转移酶基因tobM2进行了阻断研究.以妥布霉素生物合成基因簇为模板,构建了同源重组质粒pMB4,通过接合转移将质粒pMB4导入黑暗链霉菌Tt-49,然后利用红霉素抗性筛选并经PCR验证,获得了一株基因tobM2被阻断的工程菌TW402.发酵及代谢产物分析结果表明:工程菌总效价略有下降,约为出发菌株的85%.TLC检测与质谱分析显示,工程菌TW402主产安普霉素,并积累中间产物尼泊拉胺.TobM2转化尼泊拉胺生成妥布霉素,tobM2基因的缺失阻断了妥布霉素的生物合成,获得一株主产安普霉素工程菌.     

sisI替换genP在绛红小单孢菌G1008中的功能表达

将依纽小单孢菌3′,4′-双脱羟基基因sisI组合到绛红小单孢菌G1008中,替代其中的同工异源酶基因genP,研究sisI基因异源表达的内在特征.以温敏型质粒pKC1139作为克隆载体,构建sisI替换genP的重组质粒pIP303,利用接合转移技术,将穿梭质粒导入绛红小单孢菌G1008基因组,影印筛选并通过PCR(聚合酶链式反应)鉴定,获得一株基因重组工程菌GIP95.借助TLC(薄层色谱)、HPLC(高效液相色谱)和MS(质谱)检测代谢产物组分及结构变化,结果表明突变株GIP95的代谢流未被阻断,仍能够合成庆大霉素C族组分.由此得出结论,外源基因依纽小单孢菌3′,4′-双脱羟基基因sisI参与了庆大霉素生物合成中绛红糖胺3′,4′-双脱羟基这一关键步骤,在绛红小单孢菌G1008中实现异源表达.