产气荚膜梭菌β_2-β_1融合基因的构建及初步表达

目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达。方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收0.73kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别。结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达。     

牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化

目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变

目的　克隆产气荚膜梭菌 β2 毒素基因 ,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变 ,构建β2 毒素基因的突变体。方法　利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中 ,扩增出约 0 7kb的基因 ,将其克隆至pGEM T载体上。经GOLDKEY软件分析抗原表位 ,PCR定点突变技术进行 2 34位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变。结果　β2 毒素基因核苷酸序列与报道的一致 ,其突变基因 6 99位核苷酸由T→G。结论　已成功克隆了 β2 毒素基因 ,并准确实施了预期定点突变。     

产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化

目的克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(E.coli)中表达并纯化α毒素。方法设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aCPA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,并对重组蛋白进行纯化。结果双酶切和测序鉴定结果表明,CPA基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中;表达的重组蛋白相对分子质量约为43 000,主要以可溶性形式表达,最佳培养基为TB培养基,最佳诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;纯化的重组蛋白纯度达95%以上,浓度为0.663 mg/ml,收率为5 mg/g湿菌。结论成功在E.coli中表达了CPA,纯化后的CPA纯度较高,为进一步研究其结构、功能、致病机制及制备抗α毒素人源单链抗体奠定了基础。     

产气荚膜梭菌毒素β1的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

目的 原核表达产气荚膜梭菌毒素β1(Clostridium perfringens Beta1 toxin,CPB1),建立该毒素抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用基因工程技术获得cpb1基因,克隆至载体pET32a,构建重组质粒pET32α-cpb1,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CPB1。以重组蛋白CPB1作为包被抗原,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立CPB1抗体的间接ELISA检测法。并以CPB1的单克隆抗体McAb 1K19为一抗,优化包被蛋白的包被浓度、一抗稀释度、封闭时间及二抗稀释度,确定方法的临界值,验证方法的特异性、精密性、灵敏性。采用建立的方法检测201份正常牛血清样品及阴性、阳性小鼠血清样品。结果 表达的重组蛋白CPB1相对分子质量约为54 000(CPB1蛋白与硫氧化还原蛋白的融合蛋白),主要以包涵体形式表达。包被蛋白最佳浓度为10μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶16384,最佳封闭时间为120 min,二抗最佳稀释度为1∶1 000。除B和C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C. p...     

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。     

水中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测

《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)附录A中对产气荚膜梭菌给出了0 CFU/(100 mL)的限量值,但并未指定相应的检测方法.因此,对目前现行有效的3个检测产气荚膜梭菌的检测标准(GB 4789.13—2012、GB/T 8538—2016和SN/T 0177—2011)进行汇总对比.对购买的产气荚膜梭...     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

饮用水中产气荚膜梭状芽孢杆菌滤膜法检测的优化

产气荚膜梭状芽孢杆菌是在自然环境中广泛存在的一种具有致病性的微生物,该细菌为《食品安全国家标准饮用水天然矿泉水检测方法》(GB 8538—2016)中常规检测项目。随着如今人们对饮用水微生物安全性的愈发重视,在近期发布的《生活饮用水标准检验方法第12部分:微生物指标》(GB/T 5750.12—2023)中也加入了该项目的检测。文章从耗材、检测条件等方面对检测方法进行了优化,结果发现培养基、滤膜材质、孔径和贴膜方式对检测结果有重要影响,采用优化对比后的方法,使用成品A培养基、一次性混合纤维素滤膜(0.22μm),反向贴附于培养基上,于36～37℃培养,可以提高检测的准确度。     

艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段的表达及纯化

目的表达并纯化艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段,为制备高效防治艰难梭菌感染的疫苗和诊断抗原奠定基础。方法提取艰难梭菌染色体基因组DNA,用PCR扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达产物经金属螯合层析纯化,用SDS-PAGE进行分析。结果已成功地克隆了艰难梭菌细胞毒素B羧基末端重复区域的1848bp的基因,经双酶切、PCR和测序鉴定,插入到载体的基因与GenBank中公布的艰难梭菌VPI10463ToxinB3基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的相对分子质量为71300,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的14%,包涵体占沉淀的82·7%,纯化后可溶性蛋白浓度为0·781mg/ml。结论所构建的含艰难梭菌ToxinB3基因的pET22b(+)CDB3重组质粒能高效表达目的基因。金属螯合层析纯化重组蛋白CDB3的方法简便,特异性好。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法克隆LTD基因片段,插入p ET-28a载体,构建重组原核表达质粒p ET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21(Rossetta),经IPTG诱导表达。融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价。结果构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别。血清抗体效价可达1∶6 400。结论成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

中国株HIV-1融合基因gag-gp120在大肠杆菌中的表达

<正>艾滋病是目前人类最难控制、耗资最大的一类病毒性疾病,引起艾滋病的主要病原为HIV-1。GaP蛋白是HIV-1的主要结构蛋白之一,它在病毒的复制、成熟、感染和形态维持等方面均起着重要的作用,并能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。由于它在不同毒株间相对保守,因此,其诱导的抗体水平在临床上成为HIV感染的主要检测指标。Gp120蛋白是由HIV-1Env蛋白经剪切而形成的,在gp120上的C2区及其羧基末端等都与中和抗体的产生有关,因此,它已作为首选的HIV-1亚单位疫苗和重要的诊断试剂。在大肠杆菌中表达外源基因具有操作简便,成本低廉等优点。尽管有些表达的产物不能被忠实地翻译后加工,但可作为检测和诊断方面的研究。     

HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。     

RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒的构建及其在Vero细胞中的表达

目的 构建RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达.方法 应用重叠延伸PCR方法,采用一定的linker序列(Gly4Ser)2将已克隆的狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein,RV-G)基因片段和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli heat-labile e...     

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体的构建及其在SP2/0细胞中的表达

目的构建牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中表达。方法利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64、esat-6基因和mpb64-ag85b融合基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcMAE。将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果真核表达质粒pcMAE经酶切鉴定及测序,证实构建正确,转染后SP2/0细胞膜上出现均质的蓝绿色荧光。结论已成功构建了牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中获得表达,为进一步研制牛结核病多基因融合DNA疫苗奠定了基础。