肠病毒71型空斑检测方法的建立

目的建立肠病毒71型(EV71)空斑检测方法,为EV71生物学特性及疫苗的研究提供手段。方法将不同稀释度的5株EV71分别接种至单层RD细胞和Vero细胞,加入甲基纤维素覆盖,计数空斑,并计算病毒滴度。通过3次连续检测,验证空斑法的精密性,并对空斑法与微量细胞病变法检测病毒滴度的结果进行比较。结果采用RD细胞和Vero细胞,通过空斑法对EV71病毒滴度进行检测,96h后均能规律地出现边缘整齐、清晰的空斑,RD细胞和Vero细胞检测的空斑直径分别为1～2mm和0.5～1mm。连续3次重复试验结果显示,试验间变异系数的平均值Vero细胞为2.52%,RD细胞为4.49%。空斑法与微量细胞病变法比较,其检测结果具有良好的线性相关性,相关系数为r=0.972,P=0.006。结论已建立了精密性好、出斑规律的EV71病毒空斑检测方法。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白的新城疫重组病毒的构建及其免疫原性

目的利用新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传系统构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的重组病毒,并以BALB/c小鼠为动物模型,评价其免疫原性。方法在已建立的NDV反向遗传系统的基础上,将RSV F基因插入NDV全长cDNA克隆中,构建并拯救获得表达RSV F蛋白的重组病毒r LS/RSV-F。采用间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)法鉴定RSV F蛋白的表达;以HA、病毒半数鸡胚感染量(50%infective dose,EID50)、半数组织感染量(50%tissue infectious dose,TCID50)及生长曲线等生物学指标对其生物学特性进行鉴定;将r LS/RSV-F滴鼻免疫BALB/c小鼠,于免疫后第49天经眼眶后静脉丛采血,分离血清,ELISA法检测IgG抗体效价,中和试验检测中和抗体效价。结果成功拯救表达RSV F蛋白的NDV重组病毒r LS/RSV-F,具有与亲本病毒相似的感染能力及生长动力学特性;r LS/RSV...     

人呼吸道合胞病毒适应株筛选及其生物学特性

目的建立在Vero细胞上低温传代的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)适应株,并分析其生物学特性。方法从155份肺炎儿童痰样中经PCR、测序鉴定出14株RSV,将其在Vero细胞上37℃传代第1次收获的病毒记为野毒株(wild-type,WT),通过逐步降低培养温度的方法在Vero细胞传代获得1株适应株(adapted-strain,AS)KM516-AS。将RSV适应株感染A549细胞后,分别至37、25、32和39℃培养,测定其冷适应性和温度敏感性。分别将RSV适应株及其对应的野毒株KM516-WT经鼻腔免疫小鼠,于免疫后第8天,取肺组织制作病理切片,显微镜下观察病变程度;取鼻甲和右肺匀浆组织,制备上、下呼吸道匀浆液,测定上、下呼吸道病毒滴度;于免疫后第13天,经小鼠尾部静脉采血,分离血清,于免疫后第14天,取肺组织制备匀浆液,采用ELISA法测定总抗体滴度,病毒中和试验法测定中和抗体滴度。结果 RSV野毒株KM516-WT的适应温度范围较广,4个不同温度下的病毒滴度变化不大;RSV适应株KM516-AS的适应温度范围较窄,25℃时的病毒滴度最高,随着温度的升高,病毒滴度逐渐降低,且仅有温度敏感性而无冷适应性。野毒株组小鼠肺部呈暗褐色,无严重的实质化,且肺泡和毛细血管中有明显的淋巴浸润;适应株组小鼠肺泡和毛细血管中淋巴浸润较少。适应株在体内的复制水平低于野毒株,并同野毒株一样具有较好的免疫原性。结论获得1株RSV适应株,并具有一定的减毒效果。     

森林脑炎病毒滴度检测蚀斑法的建立及验证

目的 建立原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞适应的森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)株(简称PHKT株)感染性滴度检测的蚀斑法，并对建立的方法进行验证。方法 将主代鼠脑适应株TBEV感染原代地鼠肾PHK细胞，连续传12代。分别采用蚀斑法(将不同代次PHKT以不同稀释倍数感染单层BHK-21细胞，中性红染色，计算蚀斑数)和小鼠脑内攻毒滴定法(将不同代次PHKT以不同稀倍数经脑腔攻击小鼠，0.03 mL/只，连续观察14 d,Reed-Muench方法计算半数致死量)检测PHKT滴度，并对两种方法检测结果的相关性进行分析。对建立的检测TBEV滴度的蚀斑法进行专属性、重复性和中间精密度验证。结果 PHKT病毒蚀斑滴度最高达8.9 lgPFU/mL；蚀斑法与小鼠脑内攻毒滴定法检测结果相关性较好(r=0.92)；蚀斑法检测PHKT病毒感染性滴度专属性良好，重复性和中间精密度变异系数(CV)均<5%。结论 建立了检测PHKT感染性滴度的蚀斑法，可作为小鼠脑内攻毒滴定法的替代方法。     

我国黄热减毒活疫苗的均匀性分析

目的分析我国黄热减毒活疫苗的均匀性。方法采用重量法测定同批疫苗的装量差异;空斑法测定同批号10支疫苗之间的病毒滴度差异;挑取20个病毒空斑,分析这20个空斑病毒亚克隆株的生长特点和空斑形态的一致性,并选取其中4个亚克隆株进行全基因组序列测定,比对分析不同亚克隆株的基因突变情况。结果同批黄热减毒活疫苗装量差异为-3. 4%～2. 83%;同批号10支疫苗的病毒滴度几何均数为5. 12 LgPFU/mL,SD为0. 16 LgPFU/mL,CV为3%;20个空斑病毒均在传代后第5天引起■的细胞病变;同一时间收获的20个空斑病毒的病毒滴度均大于7. 0 LgPFU/mL,CV为2%;20个空斑病毒亚克隆株所形成的空斑与疫苗空斑形态相似;2个空斑病毒未发生任何有义突变,1个空斑病毒发生了1个有义突变(NS5),1个空斑病毒发生了5个有义突变,其中4个位于非结构蛋白,1个位于C蛋白。结论无论是从装量差异、病毒滴度差异、疫苗不同空斑病毒亚克隆株表型和基因型的差异,我国黄热减毒疫苗均表现出了良好的均匀性。     

鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备

目的建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础。方法通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID5)0,并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性。结果NB324K细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48h及2h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48h收获,病毒滴度最高。制备的病毒液的平均滴度为8.69CCID50/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立

目的确定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4~9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7~9 d收获病毒液;配方1(0.1%人血白蛋白)为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

流行性出血热病毒单克隆抗体的研究

应用流行性出血热病毒(EHFV)Z_(10)株制备的疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与BALB/c小白鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,获得10株能分泌ENFV特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其McAbs小鼠腹水荧光抗体滴度达1:2000～1:51200。经免疫印迹试验及ELISA夹心法证明1 0株McAbs为抗EHFV核蛋白(NP)的McAb,均不具有中和抗体活性,有低滴度的血凝抑制活性;经间接免疫荧光试验(IFAT)证明,2株为组特异性的McAb,5株为亚组特异性的McAb,3株为型特异性的McAb。实验用冻存免疫脾细胞进行杂交获得成功,为杂交瘤细胞的研究提供了经验。     

人呼吸道合胞病毒A_2株在不同细胞中的培养及其影响因素

目的在不同细胞中培养人呼吸道合胞病毒(HRSV),并分析其影响因素,为病毒的大量增殖创造条件。方法将HRSVA2株分别接种至人二倍体KMB17细胞、Vero细胞、人喉癌Hep-2细胞及HeLa细胞进行培养,采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度,并进行间接免疫荧光试验及合胞体观察。检测吸附时间、维持液pH值和培养温度对病毒增殖的影响。结果4种细胞中,Vero细胞对HRSV最敏感,病变早、病毒感染性滴度可达6.83lgCCID50/ml;KMB17细胞相对敏感性不高,但仍能良好增殖,病毒感染性滴度达6.13lgCCID50/ml;Hep-2细胞及HeLa细胞介于Vero细胞和KMB17细胞之间,病毒感染性滴度也达到6.83lgCCID50/ml。间接免疫荧光试验显示病毒在细胞浆内增殖。吸附时间对HRSV的增殖无明显影响;维持液的pH值对HRSV的增殖及病变特点均有一定的影响,在pH7.0～7.2时可快速引起细胞产生病变,并能达到最高感染性滴度;HRSV在37℃及32℃下培养均能良好地增殖。结论HRSVA2株在KMB17、Vero、Hep-2及HeLa细胞内均可增殖,但敏感性有一定差异,且对培养条件有一定的要求。     

痘苗病毒滴度测定用国家标准品的制备

目的制备病毒载体疫苗滴度测定用国家标准品。方法以鸡胚成纤维细胞制备痘苗病毒,经密度梯度超速离心纯化后,加入天花疫苗保护剂,分装冻存,分发至我国4个不同实验室,按照统一的结晶紫染色蚀斑法实验方案进行协作标定,每次实验稀释后取2个稀释度,每个稀释度设5个平行孔,计算各实验室检测结果的几何均数,对标准品中痘苗病毒滴度进行赋值。检测病毒标准品于不同温度下保存不同时间的稳定性,并对病毒标准品的各项质量指标进行检定。结果 4个实验室共测定44次,4个实验室间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05),各实验室检测结果的几何平均数为3.05×106PFU/ml,95%CI为2.00×106～4.65×106PFU/ml,标准差为0.09,总变异系数1.41%。制备的痘苗病毒标准品于4℃可稳定放置10 d,37℃放置稳定性较差。制备的痘苗病毒标准品装量检查合格(1 ml/支);pH值为6.9;无菌试验合格;分装重量精密性为0.95%。结论制备的痘苗病毒标准品可作为痘病毒载体疫苗滴度测定用标准品。     

森林脑炎病毒不同感染途径对小鼠模型的感染性分析

目的分析森林脑炎病毒不同感染途径对小鼠模型的致病性、病毒分布及增殖动态。方法将适应原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞的森林脑炎病毒进行10倍系列稀释,取4个连续稀释度的病毒液,分别通过脑腔注射、灌胃、滴鼻、肌肉注射、腹腔注射的感染方式,对昆明小鼠进行攻毒,逐日连续观察14 d,计算半数致死量(median lethal dose,LD₅₀);并分别取攻毒后第3、5、7天发病典型的腹腔感染组小鼠脑、肺、肾脏、肝脏、心脏、小肠、血液7种组织器官,采用蚀斑法检测病毒滴度。结果脑腔、灌胃、滴鼻、肌肉注射和腹腔注射攻毒方式的LD₅₀分别为10、10^5.1、10⁵、10^1.2和10²PFU/mL。所有攻毒途径小鼠的脑腔中病毒滴度最高,达10⁹PFU/mL,肺组织为10^6.5PFU/mL,肾脏为10⁵PFU/mL,心脏和肝脏中病毒滴度较低,分别为10²     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究

目的　对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法　应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果　疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论　SA14 14 2生产毒种及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E区核苷酸的特性是十分稳定的     

SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备

目的建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证。方法通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株。分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法。并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40。结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间最早,病变最明显,产毒量最高。SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响。病毒的最佳吸附时间为120 min。接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度最高,平均为8.81 lg CCID50/ml。结论已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础。     

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性

目的探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性。方法轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上。用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测。结果经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱。通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖。以0.05MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96h。连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定。结论轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

人呼吸道合胞病毒荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立人呼吸道合胞病毒(hRSV)荧光PCR(FQ-PCR)检测方法,并确定其最低检出限。方法针对hRSVN基因相对高度保守的序列,采用引物和探针设计软件PrimerExpressv2.0,设计1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针,组装成荧光PCR检测试剂。以此试剂检测345份咽拭子样品,与ELISA法检测hRSVIgM抗体比较,确定最低检出限。结果该方法的最低检出限是传统的病毒滴度测定的104.79倍。与IgM抗体检测法相比,对于感染早期患者具有更高的检出率。结论建立的hRSVFQ-PCR检测方法具有简便、快捷的特点,适用于hRSV感染的早期诊断。