毕赤酵母表达鼠李糖苷酶的甲醇流加方式优化

利用毕赤酵母发酵生成鼠李糖苷酶。依据已有毕赤酵母发酵动力学模型,设定最优化问题。根据泛函极值存在必要条件,将最优化求解问题转换为微分代数方程求解问题。利用迭代循环确定最优乘子并求解最优甲醇流加轨迹。实验证明,由此种方法获得的甲醇流加速率曲线,可以使毕赤酵母表达的鼠李糖苷酶产量有所提高。      

α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在毕赤酵母中的表达及应用

α-L-鼠李糖苷酶对天然产物之间的转化具有重要的作用和应用价值.该研究采用毕赤酵母表达 α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE,构建pPIC9K-AnRhaE表达载体,电转化至毕赤酵母GS115和KM71H中,经诱导表达,SDS-PAGE电泳显示GS115更有利于生产AnRhaE酶.AnRhaE酶在45～55℃时酶活力高,最适...     

α-L-鼠李糖苷酶的研究进展

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。该文综述了α-L-鼠李糖苷酶的来源、分类、特性及应用等。     

多点突变提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体。结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1. 13倍,1. 44倍;在65℃的半衰期分别提高了1. 64倍,1. 64倍;在70℃的半衰期分别提高了1. 88倍,1. 68倍。对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、"-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关。     

耐久肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶的液体发酵培养基优化研究

通过单因素试验及正交试验确定最佳碳源、氮源和无机盐浓度.最佳培养基的基本组成为蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3mmol/L.最佳培养条件为培养温度34℃,发酵时间4d,70mL培养基的接种量为3%.     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶结构特征规律分析

为了研究所有曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构特征,利用NCBI数据库收集到291条无重复的曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列并通过进化树筛选得到21条具有代表性的蛋白序列,通过序列比对分析得到这21条序列相互独立具有可靠的代表性,并利用生物信息学工具对其理化性质、跨膜区、信号肽进行分析发现,曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶的等电点(p I)范围为4.66～7.17,在氨基酸数量、分子量、原子总数上波动较大,其中有10条序列拥有信号肽,1条序列为两次跨膜蛋白,21条序列都为亲水性蛋白;对其进行进化树构建、三级结构建模及结构叠合发现,这21条代表性序列的蛋白结构可以被分成两大类型,第一大类型含有1个(α/α)6桶状结构和在桶底的1个β片层结构,并根据额外含有的β片层数量的不同再被分成4个小类;第二大类型拥有1个(α/β)8结构和环绕在桶装结构域周围的β片层结构,阐明了曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的蛋白结构特征,这有助于更好的明确α-L-鼠李糖苷酶的共性规律,为改造该酶提供理论指导。     

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha(对硝基苯基-鼠李糖苷)为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。     

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha（对硝基苯基-鼠李糖苷）为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。      

毕赤酵母流加培养诱导生产植酸酶的流加控制策略

对毕赤酵母流加培养生产植酸酶过程中的底物和诱导剂流加策略和性能进行了比较研究。在生长期采用基于DO/pH在线测量的人工神经网络状态模式识别控制法(ANNPR-Ctrl)特别有效。它可大幅度提高细胞生产强度,并使以甲醇为诱导剂的植酸酶诱导生产时刻提前。然而,在诱导期ANNPR-Ctrl和pH-Stat法等均不能有效地提高植酸酶酶活。为此,在生长阶段采用ANNPR-Ctrl法,当菌浓达到一个较高水平后,引入一个5~6 h的过渡期,并在此阶段继续利用ANNPR-Ctrl法流加葡萄糖和甲醇的混合物,使细胞对甲醇逐步产生适应。最后,利用纯甲醇和离线检测甲醇的控制方法开始诱导。在此阶段,离线控制可粗略地将甲醇浓度控制在5~15 g/L的范围内,酶活高达320 U/mL,比3种基本控制方式提高了5倍。同时,ANNPR-Ctrl法和离线检测甲醇控制模式的有效组合还缩短了酶活达到最高水平的时间。     

毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面时重组酵母摇瓶发酵务件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要.同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究.发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加.     

毕赤酵母工程菌ZLHY6发酵条件优化

以筛选得到的活性强并导入玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组毕赤酵母ZLHY6为出发菌株,通过响应面法优化培养基。结果表明:经过对增殖培养基BMGY的优化,获得适合毕赤酵母ZLHY6生长的最优培养基配方:3.5%甘油、0.65%酵母提取物、10%磷酸钾缓冲液、1.25%硫酸铵、0.45%硫酸镁、0.04%硫酸钙。     

毕赤酵母高效表达人乳铁蛋白的研究

将人乳铁蛋白全长基因克隆至酵母表达载体pPIC9K中，并建立hLF／pPIC9K／SMD1168酵母表达系统，在细胞高密度发酵条件下，乳铁蛋白表达量约1000mg／L，并具有天然蛋白相似的糖基化结构。本研究为商业化生产人乳铁蛋白提供了理论依据。     

Effects of methanol feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris

The effects of two types of methanol feeding methods in a continuous culture of Pichia system on the cell growth and recombinant protein expression were studied using chimeric alpha-amylase as a model protein. With the feeding of methanol by a DO-stat method, the alpha-amylase concentration in the fermentation broth increased with decreasing dilution rate and reached 173 mg/l at a dilution rate of 0.013 h(-1), at which the maximum volumetric productivity of alpha-amylase was obtained. Although almost the same productivity was attained at 0.04 h(-1) with continuous methanol feeding, the alpha-amylase concentration was one third that compared with feeding by the DO-stat method, that is, 55 mg/l. Furthermore, at this dilution rate, the medium volume needed per unit time was three times that required when DO-stat was used. Therefore, continuous culture with methanol feeding by the DO-stat method may be a promising method for the production of recombinant proteins on an industrial scale by Pichia pastoris.     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。     

响应面法优化CALA在毕赤酵母中的组成型表达

南极假丝酵母脂肪酶A (CALA)是现有研究中唯一一种对甘油三酯sn-2位显示出偏好的脂肪酶.本文在完成CALA在毕赤酵母中组成型表达的基础上,为了提高CALA的酶活,采用响应面法建立了CALA发酵培养基和培养条件的二阶数学模型,并验证了模型的有效性;筛选出了2个影响毕赤酵母发酵产CALA的主要因素:培养温度、葡萄糖含...     

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。     

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。