化学法改性溶菌酶抑菌性及其结构研究

采用化学法改性溶菌酶,以EDAC作为缩合剂,肉桂酸、咖啡酸和对香豆酸作为改性剂,形成一定程度的改性酶,并对改性酶的抑菌性及结构进行研究。结果表明:与天然酶相比,改性酶的活力有所下降,但是对革兰氏阴性菌的抑制作用增强,咖啡酸改性酶和对香豆酸改性酶对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度均为0.5 mg/mL,肉桂酸改性酶为0.75 mg/mL,但对革兰氏阳性菌的抑菌能力有所降低,咖啡酸改性酶和对香豆酸改性酶对金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌的最小抑菌浓度均为1.25 mg/mL,肉桂酸改性酶对二者的最小抑菌浓度分别为1.25 mg/mL和1.50 mg/mL,3种改性酶的各二级结构含量均发生一定的变化。     

鸭卵清溶菌酶的分离纯化及性质

通过硫酸铵的分级沉淀、CM-Sepharose阳离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,从鸭卵清中获得电泳纯的溶菌酶,该酶的比活力达到33687.26U/mg,纯化倍数为109.44,回收率为28.00%。测得该酶分子质量约为14.82kD,对溶壁微球菌的最适反应温度为50℃,最适pH值为7,且在50℃以下及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为0.0864mg/mL。Fe2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用,而Zn2+、Cu2+、Co2+对该酶有一定的激活作用。     

溶菌酶活力测定方法的改进

本文以壳聚糖代替溶壁微球菌作底物测定溶菌酶的活力。实验证明:在55℃,pH=4.5时,达到最大酶反应速度。酶浓度在0～4.5U/ml范围内符合郎伯-比尔定律,回归方程为Y=0.2173X-0.0114,线性相关系数为γ=0.9998。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

基于溶胶-凝胶法的羊毛织物溶菌酶固定

 为了增强羊毛织物的抗菌性,采用溶胶-凝胶法将溶菌酶固定在羊毛织物上,以期获得良好的抗菌效果。探讨了溶菌酶固定化的主要工艺,得到最佳工艺条件：丙基三甲氧基硅烷（PTMS）与正硅酸甲酯（TMOS）物质的量比为4：1,水与硅源物质的量比（R值）为32,溶菌酶质量浓度为25mg/mL,稳定剂PVA0588 质量浓度为2mg/mL。羊毛织物固载的溶菌酶具有较好的热稳定性和操作稳定性,40℃下保温100min仍能保持初始酶活的96%,连续使用7次仍能保持初始酶活的52.3%。     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取优化

为了获得较高酶活力的嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP),对嗜酸乳杆菌CEP的提取方法进行优化。经过比较超声波破碎法、Ca2+-free法、溶菌酶裂解3种方法,确认溶菌酶裂解法结合使用非离子清洁剂破壁是提取嗜酸乳杆菌CEP的最佳方法。在单因素试验的基础上,采用正交试验对嗜酸乳杆菌CEP的提取工艺进行优化,得出嗜酸乳杆菌CEP的最佳提取方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、TritonX-100添加量1%、1.5mg/mL溶菌酶,pH 7.8)悬浮菌体(20mL/g),37℃保温3h,4℃、4500r/min离心20min,取上清液。溶菌酶裂解法提取CEP过程中各因素对CEP提取效果的影响依次为：溶菌酶质量浓度＞裂解pH值＞TirtonX-100添加量＞保温时间。     

人溶菌酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

人溶菌酶是一种天然广谱抑菌物质,在食品和医药工业有潜在应用前景。为获得高活性的人溶菌酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母表达系统,对经密码子优化的人溶菌酶基因(h LYZ)进行分泌表达。将人工合成h LYZ插入到乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC1,构建重组载体p KLAC1-h LYZ,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过全细胞PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌h LYZ1。工程菌可以分泌表达分子量约14 ku的目的蛋白质,与预期大小相符。摇瓶发酵培养128 h,酶活最高达到1430 U/mL。抗菌活性检测结果显示,重组人溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较好的溶菌活性。本研究成功地在乳酸克鲁维酵母中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母表达系统规模化生产重组人溶菌酶奠了基础。     

鲶鱼骨酶解物抑菌性能研究

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌3种菌为受试菌,研究了鲶鱼骨酶解物的抑菌性能,并初步探讨了鲶鱼骨酶解物抑菌作用的稳定性。结果表明,鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌都有明显的抑制作用,其中对藤黄微球菌抑制作用最强,其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别是6 mg/mL和8 mg/mL,鲶鱼骨酶解物的抑菌活性具有较好的热稳定性和pH不稳定性。     

利用响应面法优化溶杆菌UCo1产溶菌酶的发酵培养基

采用响应面法对溶杆菌UCo1产溶菌酶的培养基进行了优化。首先对溶杆菌UCo1产溶菌酶的发酵培养基进行了单因素试验,确定了影响产酶的3个显著因素,即碳源麦芽糖,氮源大豆蛋白胨和表面活性剂Tween-20。采用Box-Behnken响应面法对溶菌酶的发酵培养基组成进行了优化,确定了最佳条件。结果表明,麦芽糖,大豆蛋白胨和Tween-20 3因素的最佳浓度分别为1.725%,3.25%,0.048%时,溶菌酶酶活达到6973.5U/mL,与模型所得到的最大预测值6990.99U/mL基本吻合,且较优化前的酶活力(6230.4U/mL)提高了11.93%。     

阿魏酸化学修饰溶菌酶及扩展抑菌谱的研究

为了使溶菌酶扩展抑菌谱,同时作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,本文采用了阿魏酸修饰溶茼酶.采用EDAC作为缩合剂,使溶菌酶赖氡酸残基上的ε-氨基共价结合阿魏酸的羧基,形成一定程度的阿魏酸修饰酶结果显示:与天然溶菌酶相比,修饰酶的酶活力略有下降,但是修饰酶扩展了抑菌谱,对革兰氏阴性菌的抑菌作用增强.修饰酶对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度均为0.5mg/mL,而对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略有下降.