重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

目的:在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD(H2S内源产生关键酶),确定最佳诱导表达和纯化条件,并研究重组酶的酶学性质。方法:对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果:重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导3 h。500mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明,酶的最适pH为9.5,最适作用温度为37℃,最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数(Km)为1.572 mmol/L,Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg2+,Fe3+和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用,Ba2+、Ca2+和Co2+在一定程度上提高了酶的活性,其中Co2+效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论:明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件,为该LCD的深入研究和气体信号分子H2S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质。方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性。用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究。结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性。该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2+和Zn2+的强烈抑制。结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础。     

非对称二甲基精氨酸水解酶的表达纯化及其酶学性质的研究

非对称二甲基精氨酸水解酶(dimethylarginine Dimethylaminohydrolase,DDAH)是酶学循环法检测早期急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的生物标记物——非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的重要工具酶。为获得高活性DDAH,从绿脓杆菌的基因组中扩增目的基因,构建高效表达DDAH的重组菌E.coli BL 21(pET-28a-DDAH)。该菌的可溶性DDAH表达量达100mg/L,经超声破碎后的上清液通过镍柱纯化,可获得纯度达到95%以上的重组DDAH。Q柱的精制可提高它的稳定性,使其能够在常温下长期保持酶活。该重组酶的单位酶活,Km值和Vmax分别为0.5U/mg,3.04 mM和8.07mM/h。最适反应温度和pH分别为35℃和pH=6,在10℃～40℃和pH5.0～pH9.0的范围内稳定。该重组酶可形成多聚体,但并不影响酶活。最后,利用发酵罐扩大生产规模,有望进行克级生产,为新型ADMA检测试剂盒的开发和药物筛选模型提供材料基础。     

麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75%。将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶。将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖。经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。     

L-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究

为提高微生物产L-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)与表达载体pET28a连接,导入E.coli BL21(DE3),实现LGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组L-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质进行了研究。结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/L下,30℃诱导6 h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.0;Km值为2.12 mmol/L,Vmax为1.06μmol/min.mg,对L-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景。     

GshF在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

谷胱甘肽是参与细胞活动的最普遍的非蛋白巯基化合物,是机体内重要的活性三肽,因其抗氧化作用而在医药、食品、化妆品等行业有着广泛的应用,生物合成是制备谷胱甘肽的主要方法,一直引起广泛关注。近年来发现的双功能酶GshF可同时催化谷胱甘肽生物合成的两步反应,有望提高酶法催化产谷胱甘肽的效率,但该酶的酶学性质尚未得到充分研究。克隆了来自Streptococcus thermophilus的双功能酶基因gshF,并用大肠杆菌表达,研究表明,重组菌于37℃培养4 h后经0.1 mmol/L IPTG诱导,然后在30℃下表达,胞内酶活可达44 U/L。表达产物经破胞、离心、亲和层析等步骤分离纯化后,进一步考察了其相关酶学性质,结果表明,该酶最适pH为8.0,最适温度为37℃,还研究了其最适pH和温度下的稳定性。最终通过重组菌酶法催化合成谷胱甘肽得到的最高产量为2.11g/L。这些对该酶在谷胱甘肽生物合成上的应用有重要的借鉴作用。     

地衣芽孢杆菌谷氨酰内切酶的克隆表达与性质研究

谷氨酰内切酶在食品行业应用广,但来源受限。以地衣芽孢杆菌ATCCl4580基因组DNA为模板,PCR扩增出670bp大小的谷氨酰内切酶基因,克隆入表达载体pET28a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在。通过与硫氧还蛋白融合、降低诱导温度和共表达分子伴侣三种策略,以期增加重组蛋白可溶性,结果表明分子伴侣对可溶性有明显提高作用,而低温和硫氧还蛋白影响甚微。将重组蛋白样品与底物(Z-Phe-Leu-Glu-pNA)进行孵育反应,结果表明,该酶可有效水解谷氨酸残基的羧基,释放出4-硝基苯胺。酶学性质研究表明,此酶的最适反应温度为42℃,最适作用pH为8.0,金属离子Mn2+对酶活有较好的激活作用。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。