国产静脉注射人免疫球蛋白制品中凝血激活物水平分析

目的分析11家中国血液制品企业共计64批次上市后的静脉注射人免疫球蛋白(immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)(p H 4)制品中凝血激活物水平,对国内IVIG制品在促凝血方面的安全性作出评估,为提高制品质量标准提供参考。方法利用非活化的部分凝血活酶时间法(non-activated partial thromboplastin time,NAPTT)、凝固法(一期法)及本实验室建立的改良凝血酶生成试验(modified thrombin generation test,M-TGT),分别测定64批次国产和7批次进口IVIG样品的NAPTT、系列凝血因子活性、活化凝血因子Ⅺ(FⅪa)的含量及凝血酶生成含量达到最高值时所需时间(time to peak,TTP),分析IVIG的凝血激活物水平。结果除国内厂家F所生产的2批IVIG中FⅪ活性为0.030~0.036 IU/ml外,其余国产62批次产品中FⅪ活性均低于试剂最低检测限未检出;所有产品中TTP均大于40 min,FⅪa含量均小于0.37 nmol/L,NAPTT均大于203 s。结论所调查的11家共计64批次的国产IVIG制品的凝血激活物水平均较低。今后在我国是否推行IVIG制品的凝血激活物检测尚需进一步研究。     

静注人免疫球蛋白生产工艺对凝血因子Ⅺ的去除效果

目的评价低温乙醇及压滤生产工艺对静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)中凝血因子Ⅺ(FⅪ)的去除效果。方法取9批次低温乙醇工艺不同阶段分离的血浆蛋白及3批次FⅡ沉淀精制和制剂阶段的样品,采用部分凝血酶时间(nonactivated partial thromboplastin time,NAPTT)试验检测样品中FⅪ的含量。结果 FⅠ+Ⅱ+Ⅲ分离对FⅪ的去除效率约为6%,FⅠ+Ⅲ分离对FⅪ的去除效率约为154%,FⅡ分离对FⅪ的去除效率约为10%。半成品中FⅪ含量稳定,且均低于30 mIU/mL。结论低温乙醇及压滤生产工艺能稳定有效地去除IVIG中的FⅪ,确保产品质量安全。     

静注人免疫球蛋白唾液酸含量测定方法的建立及初步应用

目的建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)唾液酸含量的测定方法,并用该方法对国内外IVIG制品唾液酸含量进行检测。方法根据《中国药典》三部(2015版)和《欧洲药典》8.0中的相关内容建立唾液酸含量检测的方法,对方法中的检测波长、反应体系、沸水浴时间及样品检测浓度进行优化,并验证该方法的线性范围、精密性及准确性。采用建立的方法检测国内外7个厂家的21批IVIG制品唾液酸含量,并进行比较。结果最适检测波长为580 nm;最佳N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminicacid,NANA)标准品、间苯二酚反应液、异戊醇的加入量分别为0.2、0.5、0.5 ml;最佳沸水浴时间为30 min;最佳样品检测浓度为2 mg/ml。NANA标准品在5~80μg/ml浓度范围内,与A580值呈良好的线性关系,相关系数(R2)=0.998;5批IVIG制品检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)平均值为3.72%,同一批IVIG制品于3个不同时间检测结果的RSD值为3.1%;IVIG样品的加标回收率为(98.5±7.9)%。不同厂家的IVIG制品唾液酸含量存在较大差异。结论本研究建立的方法具有良好的精密性及准确性,可用于IVIG唾液酸含量的检测。     

23F型肺炎链球菌多糖蛋白结合物游离蛋白含量检测方法的建立及验证

目的建立一种检测23F型肺炎链球菌多糖结合物游离蛋白含量的方法,并进行方法学验证。方法采用体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography and high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法检测23F型肺炎链球菌多糖结合物游离蛋白含量。色谱柱:TSKgel G3000(300 mm×78 mm,5μm);流动相:10 mmol/L PBS(150 mmol/L NaCl,pH 6. 8);检测波长:214 nm;流速:0. 5 m L/min;柱温:25℃;自动进样:100μL。同时对该方法进行线性、精密度、准确度、耐用性及专属性验证。结果建立的方法在纯化载体蛋白破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)含量为3～18μg/mL时,与峰面积呈良好的线性关系,线性相关系数(R2) 0. 99;23F-2017001、23F-2017002、23F-2017003批供试品重复性相对标准偏差(RSD)分别为0. 1%、0. 3%、1. 0%,中间精密性RSD分别为3. 7%、8. 5%、4. 8%;加入6、8、10μg/mL纯化载体蛋白TT样品的3次检测结果回收率在93. 2%～102. 6%之间,回收率的RSD均为0. 6%;进样温度为20～30℃条件下的保留时间和峰面积相对偏倚在-0. 1%～0. 5%之间;流动相溶液中含甘氨酸及低浓度硼酸时对检测结果无干扰,硼酸浓度为20 mmol/L以上时对游离蛋白峰检测有一定干扰。结论本实验建立的方法具有良好的线性、精密性、准确性、耐用性及专属性,可用于23F型肺炎链球菌多糖结合物游离蛋白含量检测。     

重组人干扰素α2a成品中蛋白含量体积排阻高效液相色谱法的建立

目的建立测定重组人干扰素α2a成品中干扰素α2a蛋白含量的体积排阻高效液相色谱法(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC),并进行验证。方法应用SE-HPLC法测定重组人干扰素α2a对照品及供试品蛋白质含量,并对方法的线性、精密度、稳定性、重复性及准确性进行验证。采用建立的SE-HPLC法检测5家企业生产的24批样品中干扰素α2a蛋白含量,同时每批样品按《中国药典》三部(2010版)方法测定生物学活性,并计算比活性(IU/mg)。结果重组人干扰素α2a在0.364 8～11.67μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.999 9)。用建立的方法连续进样6次,检测对照品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.4%;同一批样品进样12次,检测供试品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.8%;同一批样品取6份进样,检测供试品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.1%;5家企业生产的24批样品,平均加标回收率为103.5%,平均比活性为1.65×108IU/mg。结论建立了测定重组人干扰素α2a蛋白含量的SE-HPLC法,该方法简便,精密度、稳定性、重复性及准确性好,可用于重组人干扰素α2a成品中干扰素α2a蛋白含量的测定及比活性评价。     

测定13价肺炎球菌结合疫苗多糖含量的速率比浊法的建立及验证

目的建立速率比浊法测定13价肺炎球菌结合疫苗多糖含量,并进行验证。方法采用免疫化学分析系统(IMMAGE 800),用氢氧化钠解吸附处理样品,测定13价肺炎球菌结合疫苗多糖含量,并对建立的方法进行线性、精密性、准确性、专属性及溶液稳定性验证。结果该方法在本研究条件下,1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型肺炎球菌荚膜多糖浓度在0. 5～3. 0μg/mL范围内,线性良好,相关系数(r)均大于0. 985 0;各型多糖含量重复检测的相对标准差(RSD)均低于10%,中间精密性检测的RSD均低于15%;各型多糖含量检测的加标回收率在80%～120%之间;2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F、33F型肺炎球菌精制多糖在曲线浓度范围内不影响13价肺炎球菌结合疫苗各型多糖含量的检测,且19A与19F之间、6A与6B之间不存在交叉反应;13价肺炎球菌结合疫苗稀释后4 h以内测定多糖含量结果稳定。结论速率比浊法测定13价肺炎球菌结合疫苗结果准确,精密性好,可作为该疫苗的质控方法。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

前蛋白转化酶枯草溶菌素9单克隆抗体生物学活性荧光染料标记法的建立、优化及验证

目的建立并优化前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)单克隆抗体生物学活性的荧光染料标记检测法,并进行验证。方法对建立的荧光染料标记法的细胞铺板密度(1×10~5、5×10~5和1×10~6个/mL)、PCSK9蛋白浓度(5、20、40、80μg/mL)、荧光标记的低密度脂蛋白(low density lipoprotein labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate,Dil-LDL)浓度(10、16、20μg/mL)、单克隆抗体的浓度梯度(200、52、20、12、8、4、0. 8μg/mL,200、30、10、6、4、1、0. 2μg/mL,200、28、9、6、4、2、0. 2μg/mL)进行优化,并对优化方法的专属性、准确度、精密度、线性范围、耐用性进行验证。结果最适方法检测条件:铺板密度为5×10~5个/mL,PCSK9蛋白和Dil-LDL浓度分别为20和16μg/mL,单克隆抗体的浓度梯度为200、52、20、12、8、4、0. 8μg/mL。该方法可特异性检测PCSK9单克隆抗体;供试品检测回收率在70%～130%之间;供试品检测结果的相对标准偏差(RSD)均10%;供试品效价在50%～150%之间时,检测值与理论值呈良好的线性关系,线性拟合方程为y=1. 002 x-0. 006 7,R~2=0. 997 8;耐用性检测活性均在70%～140%范围内。结论本实验建立的方法具有良好的专属性、准确度和精密度,可用于PCSK9单克隆抗体的生物学活性测定。     

静注丙球激活补体活性测定方法的建立

目的　建立静注丙球 (IVIG)激活补体活性的测定方法 ,并对国内不同工艺生产的IVIG制品Fc段的生物学功能进行分析。方法　采用补体经典激活途径激活补体的方法。结果　应用该方法检测不同工艺生产的制品活性均有差别。该方法操作简便 ,重复性好。结论　将检测Fc段的生物学活性列为IVIG常规检测质控指标是可行的     

测定重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)原液纯度的高效分子排阻色谱法的建立及方法的验证

目的建立检测重组肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)(汉逊酵母)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯度的高效分子排阻色谱法(SEC-HPLC),并进行验证。方法建立SEC-HPLC法检测EV71 VLP纯度,并对该方法的专属性、精密度、检测限、定量限、耐用性及拖尾因子等指标进行验证。结果空白溶剂在设定的积分范围内无特异峰出现。重复性试验中原液参比品保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0. 14%和0. 21%,3批分析原液保留时间RSD均<0. 3%,峰面积RSD均<0. 8%;中间精密度试验原液参比品和3批分析原液保留时间RSD均<0. 2%;峰面积RSD均<2. 0%。检测限为样品浓度2. 5μg/mL,进样体积20μL;定量限为样品浓度10μg/mL,进样体积20μL。耐用性试验中原液参比品在不同浓度流动相中连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2. 0%。原液参比品和3批分析原液目的峰的拖尾因子为1. 210±0. 01,RSD为0. 90%。结论建立的SEC-HPLC方法专属性、精密度、耐用性良好,适用于EV71(汉逊酵母)VLP纯度的检测。     

狂犬病病毒糖蛋白抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立可快速检测狂犬病病毒(rabies virus,RabV)糖蛋白抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法用抗RabV糖蛋白基因工程抗体建立双抗体夹心ELISA法,检测RabV糖蛋白抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性、准确性、板内与板间精密性、灵敏度验证,对不同厂家(毒株分别为aG、PV、CTN、PM)生产的狂犬病疫苗与不同工艺阶段的狂犬病疫苗样品进行适用性检测。结果捕获抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶2 000和1∶4 000,最佳封闭剂为1. 5%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围在0. 003 2~0. 103 1 IU/mL之间,R2> 0. 98;准确性验证的回收率在97. 0%~110. 1%之间;精密性验证的板内变异系数<8. 6%,板间变异系数<13. 9%;检测不同厂家的狂犬病疫苗和不同工艺阶段的疫苗样品呈良好的剂量依赖效应。结论建立了适用于人用狂犬病疫苗糖蛋白抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于aG、PV、CTN、PM等不同毒株生产的狂犬病疫苗检测;也可用于病毒收获液、浓缩液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。     

右美沙芬愈创甘油醚糖浆质量研究

建立了测定右美沙芬愈创甘油醚糖浆中氢溴酸右美沙芬和愈创木酚甘油醚含量的HPLC方法。采用C18柱,以2%磷酸-乙腈为流动相,以280 nm为检测波长,流速为1.0 mL/min。结果表明,氢溴酸右美沙芬和愈创木酚甘油醚分离度为7,线性范围分别是50～250μg/mL(RSD=99.98%)和333.6～1 668μg/mL(RSD=99.99%);精密度RSD分别是0.29%和0.24%(n=6);重复性RSD分别是0.14%和0.12%(n=6);平均回收率为100.53%和100.62%,RSD分别为1.32%和0.41%(n=9)。本法准确可靠,简便快捷,可用于市售右美沙芬愈创甘油醚糖浆的质量监控。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)检测方法,并对其进行验证。方法将系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体加入已接种表达CD52抗原的人淋巴瘤靶细胞中,再加入人血浆冻干补体后,采用ATP显色法定量检测靶细胞的活细胞数目。对试验条件进行优化,并对方法进行专属性、准确性、精密度、线性验证。结果重组人源化抗CD52单克隆抗体在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。方法经过优化后,确定人淋巴瘤RAMOS细胞为靶细胞,抗体稀释初浓度为120μg/m L,稀释倍数为1∶1.4。不同浓度的无关抗体均对靶细胞无细胞毒性,方法专属性良好。理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样测定的相对CDC活性分别为(51.33±4.36)%、(75.80±6.31)%、(97.7±7.45)%、(133.27±10.7)%和(158.77±14.13)%,回收率均在80%~120%范围内,相对CDC活性和回收率的RSD均小于10%,方法准确性良好。将100%相对CDC活性试样重复测定6次,6次测定的相对CDC活性为(101.18±8.90)%,RSD小于10%,样品重复性良好。3个不同日期中同一实验员分别检测5个理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样的相对CDC活性的RSD均在10%以内,时间精密度良好。同一日期中2名不同实验员分别检测5个理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样的相对CDC活性的RSD均在10%以内,人员精密度良好。线性方程为y=1.065 6 x-4.026,r2=0.983 7,线性良好。结论成功建立了重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC检测方法,该方法具有良好的专属性、准确性、重复性、中间精密度和线性,可作为重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC活性的常规检测方法。     

重组人干扰素β1a生物学活性MTS/PMS检测方法的建立

目的建立重组人干扰素β1a(Recombimant human interferon beta1a,rhIFNβ1a)生物学活性MTS/PMS检测方法。方法将MTS和PMS偶联作为染色液,建立IFNβ1a生物学活性检测方法,对细胞浓度、细胞病变时间、MTS工作浓度和染色时间进行优化,并绘制效应曲线。对建立的方法进行重复性、准确性验证,并与结晶紫染色法进行比较。结果优化后的MTS/PMS法的最佳反应条件为:细胞浓度1×105个/ml,细胞病变时间24～36 h,MTS工作浓度2 mg/ml,染色时间40 min;A570/630值与IFNβ1a保护Wish细胞S型效应曲线的相关系数(R2)均达0.99以上。不同检测板、相同加样位置的变异系数在6%～20%之间;相同检测板、不同加样位置的变异系数在13%～17%之间;检测IFNβ1a细胞收集液的回收率在86%～121%之间。该法检测rhIFNβ1a生物学活性效应曲线呈反"S"型,线型较好,R2值均在0.99以上,均比结晶紫染色法的R2值高,且比结晶紫染色法更稳定。结论已建立了rhIFNβ1a生物学活性MTS/PMS检测方法,适用于常规定量测定rhIFNβ1a的生物学活性。     

螨变应原制品中苯酚含量测定通用方法的验证

目的筛选一种简便、易行的苯酚含量测定方法,作为螨变应原制品中苯酚含量测定的通用方法。方法建立比色法测定苯酚含量的标准曲线,并确定线性及测定范围;用比色法测定4种螨变应原制品中的苯酚含量,进行精密性和准确性验证;将比色法与企业标准规定方法测定结果进行比较。结果比色法6次检测结果显示,苯酚浓度在0～40μg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系,R2均≥0. 999 8;比色法测定4种螨变应原制品苯酚含量,日内精密性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)不超过2. 3%,日间精密性RSD不超过3. 5%;准确性验证回收率为98%～104%。比色法测定3家企业螨变应原制品苯酚含量,结果全部符合质量标准规定,且与各自企业标准中规定方法的测定结果一致,差异无统计学意义(P 0. 05)。结论利用比色法测定螨变应原制品中苯酚含量,重复性好,准确度高,操作简便,可用作该制品苯酚含量测定的通用方法。     

8-羟基喹啉微乳液光度法快速测定药材中总铝和活性铝

建立新的测定铝的8-羟基喹啉微乳液光度法。用8-羟基喹啉与样品提取液中的铝反应,然后用微乳液萃取,在376 nm波长处测定吸光度。在选取的适宜条件下,Al~(3+)含量在0"25μg/8 mL(8 mL是微乳液体积)内符合比尔定律,线性相关系数R2=0. 9986。重复性实验的RSD分别是活性铝为2. 4%,而总铝为3. 3%;加标回收率分别是活性铝为88. 7%～95. 9%,而总铝为96. 5%～105. 8%。本法准确可靠,适于试样中总铝和活性铝的快速分析。     

高效液相色谱法检测重组人干扰素α2b注射液中间甲酚含量

目的建立重组人干扰素α2b(recombinant human interferon α2b,rhIFNα2b)注射液中间甲酚含量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并对方法进行验证。方法采用RP-HPLC法,选用ZORBAX 300SB-C18(4. 6 mm×250 mm 5-Micron)色谱柱,流动相为水∶甲醇(50∶50),柱温45℃,上样量20μL,流速0. 5 mL/min,检测波长270 nm。对方法进行线性、专属性、准确性、精密性、定量限及耐用性验证。分别采用建立的方法及《中国药典》四部(2015版)4-氨基安替比林分光光度法测定3批rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量,比较两种方法的测定结果。结果该方法在间甲酚含量为1 000～0. 1μg/mL范围内线性良好,R~2为0. 999 3;药用辅料与IFN蛋白对间甲酚含量检测无干扰;该方法检测高、中、低3种浓度样品的平均回收率分别为97. 10%、99. 00%和103. 94%,总的平均回收率为100. 01%;重复性验证中RSD为0. 105%,中间精密性验证中RSD为0. 26%;该方法的定量限为0. 1μg/mL;同一色谱柱条件下,不同设备与不同时间配制的流动相对检测结果无明显影响;而使用不同程度色谱柱理论塔板数有明显差异。结论建立的HPLC检测方法专属性、精密性、耐用性良好,准确性高,可用于检测rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量。     

人凝血因子Ⅷ活性生物检定统计法(显色法)的建立

目的依据《欧洲药典》8.0版规定的生物统计检定法原理,建立检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性的显色法。方法采用斜率比模型中随机区组设计显色法实验,进行数据统计分析及结果计算。以FⅧ国际标准品及FⅧ原液、成品为测试样品,确定其线性范围,并验证其重复性、中间精密度、专属性;用《中国药典》三部(2010版)规定的一期法和建立的方法进行比较。结果当FⅧ效价在0~17.85 IU/L范围内时,标准品和样品的线性相关系数(r)均大于0.99;重复性相对标准偏差(RSD)为2.1%;2位实验人员测定结果经t检验,差异无统计学意义(P0.05);该方法置信限范围为80%~120%。两种方法检测结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法操作简便、快速,测定结果稳定、准确,检测水平符合《欧洲药典》要求,可用于FⅧ活性检测。     

HPLC法测定食品中三氯蔗糖

建立了测定食品中三氯蔗糖的高效液相色谱(HPLC)检测方法.采用C18分析柱,示差折光检测器,甲醇-0.125%磷酸氢二钾水溶液(4:6)为流动相,流量为0.8 mL·min-1.柱温为29℃.食品中三氯蔗糖回收率为98.7%～101%,检测限0.08μg,RSD为1.23%,在0.1～250旭范围内,呈良好的线性关系(r=0.99994).方法快速、简便、可靠.可适用于食品中三氯蔗糖的质量控制检测.     

高效液相色谱法测定依托度酸的含量

目的:建立高效液相色谱法测定依托度酸的含量。方法:采用C8(250 mm×4.0 mm,5μm)色谱柱;流动相A:6 mL磷酸与1000 mL水混合,流动相B:6 mL磷酸与1000 mL乙腈混合,梯度混合A和B;检测波长:225 nm;柱温:30℃;流速:1.0 mL/min;进样量:5μl。结果:本方法专属性较强,耐用性较好;在0.024744~0.057736 mg/mL范围内线性关系良好;在0.04 mg/mL的80%~125%范围内的总平均回收率为99.93%,RSD为0.5%(n=18);系统精密度RSD为0.05%~0.23%,重复性RSD为0.21%,中间精密度RSD为0.3%~0.5%。结论:本方法准确、可靠,可用于依托度酸含量的测定。