牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP3蛋白。方法将GPV VP3基因重组表达质粒pGEX-6P-VP3转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS内,IPTG诱导表达;用Sepharose 4B(Prepacked Glutathion)亲合层析柱纯化可溶性和不溶性包涵体蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot及Dot-ELISA鉴定。结果表达的GST/VP3融合蛋白相对分子质量为85 000,主要以不溶性包涵体形式存在;纯化的可溶性蛋白和包涵体蛋白含量分别为2.20和3.30 mg/ml;纯化的GST/VP3融合蛋白能被鹅抗GPV多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了GPV VP3蛋白,为进一步研究其功能和免疫学特性及研制基因工程亚单位疫苗和新型抗原制剂奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E. coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40 000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸...     

人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的原核表达及其免疫原性评价

目的原核表达重组人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)A型Long株截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增HRSV截短F1蛋白基因序列,克隆至pET-28b表达载体,构建重组原核表达质粒RSV F1/pET-28b,转化大肠埃希菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;用Ni亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析。将纯化的重组截短F1蛋白免疫ICR小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的截短F1蛋白相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,纯度达90.6%。重组截短F1蛋白免疫小鼠血清抗体效价最高可达1∶4 096。结论原核表达的重组HRSV截短F1蛋白免疫原性好,为单克隆抗体的制备及检测试剂盒的研究奠定了基础。     

NIRF蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

人膜联蛋白A3的原核表达及纯化

目的 原核表达人膜联蛋白(annexin,ANX)A3(ANX A3),并进行纯化。方法 提取人胎盘样品总RNA,反转录建立c DNA文库,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增anx A3基因编码区全长,连接至克隆载体p EASY-Blunt上,测序鉴定。用primix extaq酶重新扩增anx A3基因,与表达载体p EASY-E1连接,构建重组表达质粒p EASY-anx A3,转化E.coli Transetta DE3,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His纯化介质及Bio-Rad Bio Logic Duo Flow Chromatography Systems纯化后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定,阳性克隆可扩增出972 bp的目的片段,与NCBI中Gen Bank上报道的anx A3序列完全一致。纯化的重组蛋白相对分子质量约为36 000,可与鼠Anti 6×His-Tag单克隆抗体特异性结合,浓度为400μg/ml。结论 成功构建了重组原核表达质粒p EASY-anx A3,并在E.coli Transetta DE3中表达了重组蛋白,为进一步研究ANX A3在哮喘病的起因和形成中的作用及机制奠定了基础。     

翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因的优化表达及其免疫原性分析

目的原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1(wt VP1)基因进行优化(opti VP1),将基因wt VP1和opti VP1分别克隆至p GEX-6P-1原核表达系统,构建原核表达质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1,分别转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并对诱导温度、IPTG终浓度及诱导时间进行优化,诱导蛋白经Western blot鉴定;重组蛋白经GSH-琼脂糖凝胶层析纯化;分别用PBS、纯化的GST标签蛋白、纯化的重组蛋白及CSBV纯化病毒免疫小鼠,经间接ELISA法检验各组小鼠的血清抗体效价。结果优化后的VP1基因序列降低了密码子影响指数,提高了密码子适应指数;质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1经鉴定证明构建正确;最佳诱导表达条件为:IPTG终浓度0.8 mmol/L,30℃,220 r/min诱导8 h;诱导表达蛋白占菌体总蛋白百分比由wt VP1菌株(5.49±0.30)%提高至opti VP1菌株(59.7±0.51)%,纯化后纯度可达0.5 mg/ml;兔抗GST标签抗体及兔抗CSBV血清均与优化后的重组蛋白发生特异性反应;重组蛋白组小鼠二免后可产生较高水平抗体,明显高于PBS组和GST标签蛋白组(P0.05)。结论通过密码子优化实现了CSBV结构基因VP1的高效表达,表达蛋白可诱导小鼠机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性,为探讨CSBV感染的分子发病机制和制备抗CSBV病毒的多克隆抗体奠定了基础。     

人胎盘泌乳素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人胎盘泌乳素(Human placenta lactogen,hPL)。方法从正常产妇新鲜胎盘组织中提取组织总RNA,PCR扩增hPL基因,将其亚克隆至pQE-30载体,构建重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌M15(pREP4),经IPTG诱导表达。表达产物经Sephacryl S-200层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和western blot鉴定其纯度和特异性。结果重组菌pQE-hPL/M15(pREP4)经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的67%;纯化后目的蛋白纯度可达90%以上;纯化蛋白和hPL包涵体均可与羊抗hPL多克隆抗体特异性结合,具有较强的特异性和抗原性。结论已成功制备了纯度较高的hPL蛋白,为基因工程制备抗体提供了抗原。     

呼吸道合胞病毒截短G蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的构建呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)截短G蛋白的原核表达载体,并对表达、纯化后的蛋白进行免疫原性及相关免疫指标的检测。方法人工合成G蛋白基因的部分核酸序列,采用重叠PCR法将CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位,构建原核表达载体GCX3C-pET22b和GCTL-pET22b,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,免疫昆明小鼠,实验分GCX3C组(100μg GCX3C)、GCTL组(100μg GCTL)、阴性对照组(100μlPBS),分别于0、1、4周经小鼠双后侧肌肉注射免疫,经尾梢静脉取血,分离血清,检测IgG水平及嗜酸性粒细胞的数量,并通过小鼠体外淋巴细胞杀伤试验鉴定RSV特异性CTL应答。结果重组原核表达载体经双酶切及测序鉴定,证明G蛋白基因改造成功;重组蛋白的相对分子质量约14 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RSV血清发生特异性反应;小鼠血清中的特异性IgG水平随免疫次数的增加而升高(P<0.01),GCX3C蛋白和GCTL蛋白的几何平均滴度分别为1 584.89和1 995.26;GCX3C组较GCTL组小鼠血清中嗜酸性粒细胞数量明显增加(P<0.01);GCTL蛋白免疫小鼠后可产生RSV特异性的CTL应答效应。结论已成功原核表达了GCX3C蛋白和GCTL蛋白,两种蛋白均有较好的免疫原性,GCTL蛋白可消除由CX3C模序引起的嗜酸性粒细胞增多,并增强了CTL效应,G蛋白基因的改造达到了预期效果。     

产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性

目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。