激活素受体相互作用蛋白2在小鼠Hepa1-6细胞中的表达及调控

目的研究激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)在小鼠肝细胞中的表达及调控。方法采用半定量PCR技术检测ARIP2 mRNA在Hepal-6细胞中转录水平的动力学变化规律及其调控因素。结果Activin A刺激Hepal-6细胞ARIP2 mRNA的转录水平呈时间依赖性升高,刺激早期(4h)无明显变化,12h后显著升高。信号传导激动剂PMA和LPS刺激He- pal-6细胞24h,均可上调ARIP2 mRNA的转录水平,而A23187则抑制其转录。ARIP2过表达明显抑制Hepal-6细胞ActRIIA mRNA的转录水平,对ActRIIB则无影响。结论ARIP2作为激活素信号传导抑制蛋白,其表达受多种因素影响。ARIP2可能通过影响ActRIIA表达,参与激活素作用后期的信号传导负反馈调节过程。     

激活素A抑制脂多糖活化巨噬细胞的作用机制

目的探讨激活素A(Activin A)抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)活化巨噬细胞的作用机制。方法取小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,分别添加Activin A(5 ng/ml)、LPS(1μg/ml)和Activin A(5 ng/ml)+LPS(1μg/ml),同时设以含单纯2.5%胎牛血清的DMEM培养液培养的细胞作为对照孔,培养24 h后,采用还原酶法检测细胞分泌一氧化氮(Nitric oxide,NO)的水平,流式细胞术分析TLR2和TLR4蛋白的表达水平,RT-PCR分析细胞ActRⅡA和ActRⅡB基因mRNA的转录水平。结果 Activin A和LPS单独作用均促进RAW264.7细胞分泌NO,但二者联合使用时,Activin A可抑制LPS刺激RAW264.7细胞的NO分泌;Activin A能抑制LPS上调RAW264.7细胞TLR4蛋白的表达,但对TLR2蛋白的表达无影响;LPS可促进RAW264.7细胞ActRⅡA基因mRNA的转录水平,但对ActRⅡB基因mRNA的转录水平无影响。结论 Activin A通过调控TLR4途径抑制LPS的作用,LPS可能通过促进ActRⅡA的表达进一步增强Activin A的负反馈调节作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白对小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对小鼠胚胎肝干细胞(embryonic liver stemcell,ELSC)凋亡及相关蛋白Bcl2、Mcl1、Bax表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒载体系统将HBx基因转入小鼠胚胎肝干细胞ELSC14.5中,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;Hoechst33342染色法观察细胞核的改变;TUNEL法和流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR和Western blot法检测抗凋亡因子Bcl2、Mcl1和促凋亡因子Bax基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组腺病毒Ad-GFP-HBx能有效感染ELSC14.5细胞,HBx基因和蛋白均能特异性表达;感染的ELSC14.5细胞核呈现固缩,且边缘化的细胞数减少,细胞凋亡率降低;细胞中Bcl2和Mcl1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均增高,而Bax的表达降低。结论 HBx可通过调节Bcl2家族中抗凋亡因子和促凋亡因子的比例失衡,来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,促进其存活。     

ActRⅡA在小鼠巨噬细胞的表达

目的：克隆、表达重组融合蛋白ActRⅡA的C末端肽，制备抗ActRⅡA C末端抗体，并检测其在小鼠巨噬细胞中的表达。方法：构建GST－ActRⅡAC末端蛋白表达质粒，经SDS－PAGE分析表达蛋白，以GST－ActRⅡA C末端蛋白为抗原免疫家兔制备抗ActRⅡAC抗体，采用免疫细胞化学染色技术观察ActRⅡA在巨噬细胞的分布。结果：克隆得到的ActRⅡAC末端cDNA，经DNA测序证实所克隆的cDNA与GenBank收录的ActRⅡAC末端基因序列完全相符。SDS－PAGE分析表达的GST－ActRⅡA C蛋白相对分子质量约为37000。采用亲和层析纯化的抗ActRⅡAC末端抗体进行免疫细胞化学染色显示，ActRⅡA在小鼠巨噬细胞中高水平表达。结论：已成功地构建了ActRⅡAC末端表达质粒，制备了抗ActRⅡAC末端抗体并证实小鼠巨噬细胞表达存在ActRⅡA。     

抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响

目的研究抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响,探讨WWOX基因的抑癌机制。方法采用脂质体转染法将WWOX基因重组真核表达质粒转染Lewis肺癌细胞,RT-PCR和Western blot法检测WWOX基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;免疫组化法检测WWOX基因转染后Lewis细胞中c-jun蛋白的表达水平;半定量RT-PCR法检测c-jun调控的4种肿瘤相关基因p21、cyclinD1、FasL及VEGF mRNA的转录水平。结果重组真核表达质粒pcDNA4.0/Myc-His-WWOX转染Lewis细胞后,WWOX基因在mRNA和蛋白水平上均得到表达;与未转染细胞和空载体转染细胞相比,WWOX基因转染细胞胞浆中c-jun蛋白的表达量升高,而细胞核中c-jun蛋白的表达量未见明显差异;p21基因mRNA的转录水平升高,cyclinD1、FasL和VEGF基因mRNA的转录水平降低。结论WWOX基因可在Lewis细胞中表达,其转染Lewis肺癌细胞后,不直接调控c-jun蛋白的表达量,但可影响其转录活性。     

MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

目的构建胰岛素启动子肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)基因的真核表达质粒,并观察MafA基因在人肝癌细胞HePG-2中的表达及其作用,为糖尿病基因治疗的研究奠定基础。方法提取小鼠胰腺组织总RNA,经RT-PCR扩增MafA基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N2和pEGFP-C1中。用脂质体将重组表达质粒转染至人肝癌细胞HePG-2中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测转染细胞中MafA和insulinⅡ基因的转录水平,Western blot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。结果重组表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA经PCR、双酶切和测序证明构建正确;重组质粒转染的HePG-2细胞有绿色荧光蛋白表达;经RT-PCR可检测到MafA基因表达,但未检测到insulinⅡ基因表达;经Westernblot检测,在相对分子质量约70 000处可见特异性反应条带。结论已成功构建了MafA基因真核表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,以其转染的HePG-2细胞可表达MafA基因,并翻译成蛋白,但未表达insulinⅡ基因。     

肝癌细胞上清液对成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白、环氧合酶-2和肝细胞生长因子的影响

目的观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响。方法制备小鼠成纤维细胞,并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的培养液培养成纤维细胞。采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力;RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况。结果条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用,但条件培养液的促进作用更强。普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平,第3天以后转录水平稳定;普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录;条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平最高,第5天后无明显下降。不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达;普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达,而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达,表达部位均为胞浆。结论小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞,其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞。     

Notch2胞内段基因过表达对K562细胞增殖的影响及其机制

目的探讨外源性Notch2胞内段基因过表达对慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)细胞株K562增殖的影响及其机制。方法将携带Notch2胞内段(ICN2)基因的质粒转染K562细胞,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞的细胞周期分布;RT-PCR检测Notch2基因全长mRNA的转录,Western blot检测Notch2蛋白的表达;RT-PCR检测Notch通路下游靶基因Hes1、Hey1及细胞增殖、凋亡相关基因numb、Bcl-2、NF-κB和TGF-β1的mRNA转录水平。结果与未转染组相比,转染组K562细胞数量减少,增殖显著受抑(P<0.01);转染48 h后的K562细胞G1期细胞比例显著增多(P<0.01),S期细胞比例显著减少(P<0.01);Notch2基因mRNA及下游靶基因Hes1和Hey1 mRNA转录水平均明显增强(P<0.01),Notch2蛋白表达量增加(P<0.01);numb基因mRNA转录水平无变化;Bcl-2表达下调,NF-κB和TGF-β1表达上调。结论Notch2胞内段基因过表达可抑制K562细胞增殖,其机制可能是通过上调TGF-β1和NF-κB基因表达及下调Bcl-2基因表达,将细胞阻滞于G1期来实现的。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

ActRⅡA在小鼠巨噬细胞中的表达

目的　克隆、表达重组融合蛋白ActRⅡA的C末端肽 ,制备抗ActRⅡAC末端抗体 ,并检测其在小鼠巨噬细胞中的表达。方法　构建GST ActRⅡAC末端蛋白表达质粒 ,经SDS PAGE分析表达蛋白。以GST ActRⅡAC末端蛋白为抗原免疫家兔制备抗ActRⅡAC抗体 ,采用免疫细胞化学染色技术观察ActRⅡA在巨噬细胞的分布。结果　克隆得到的ActRⅡAC末端cDNA ,经DNA测序证实所克隆的cDNA与GenBank收录的ActRⅡAC末端基因序列完全相符。SDS PAGE分析表达的GST ActRⅡAC蛋白相对分子质量约为 3 70 0 0。采用亲和层析纯化的抗ActRⅡAC末端抗体进行免疫细胞化学染色显示 ,ActRⅡA在小鼠巨噬细胞中高水平表达。结论　已成功地构建了ActRⅡAC末端表达质粒 ,制备了抗ActRⅡAC末端抗体并证实小鼠巨噬细胞表面存在ActRⅡA。     

小鼠激活素受体相互作用蛋白5的基因克隆

目的克隆新的小鼠激活素受体相互作用蛋白5(ActRIP5)基因。方法应用酵母双杂交技术,筛选出与激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)相互作用蛋白的基因片段,再以此基因片段作为探针,从小鼠脑cDNA文库中钓取ActRIP5cDNA。采用哺乳动物细胞双杂交系统,进一步确定ActRIP5与ActRⅡA的相互作用。采用RT-PCR检测ActRIP5mRNA在组织中的转录。结果克隆的ActRIP5全编码基因长1839bp,编码145个氨基酸残基,与ActRⅡA具有特异结合作用。ActRIP5mR-NA在小鼠多种组织中均可检出。结论ActRIP5属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用。     

激活素A对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用

目的研究激活素A(Activin A)对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用。方法原代培养孕期17d小鼠胎鼠脑神经细胞,免疫细胞化学染色观察激活素受体(ActRIIA)在神经细胞中的表达;将原代培养神经细胞分为阴性对照组(5%胎牛血清-DMEM/F12培养基)、阳性对照组(4ng/ml神经生长因子)和激活素A(5ng/ml)组,分别于培养第1、3、5、7和9天,采用台酚蓝染色法检测神经元存活情况。结果培养的小鼠胎鼠脑神经细胞可表达ActRIIA;阴性对照组存活神经元呈时间依赖性减少,在培养第9天已检测不到存活的神经元;而阳性对照组和激活素A组在培养第9天仍有部分神经元存活。结论激活素A具有维持小鼠胎鼠大脑皮层神经元长期存活的作用。     

激活素A及其ⅡA型受体在ConA诱导小鼠急性肝损伤时的表达及其作用

目的探讨激活素A(ActivinA)及其ⅡA型受体(ActRⅡA)在刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠急性肝损伤时的表达及其作用。方法尾静脉注射ConA诱导小鼠急性肝损伤,测定血清转氨酶水平判断肝脏组织损伤程度,实时定量RT-PCR检测ActivinA及ActRⅡAmRNA转录水平;应用抗ActivinA和ActRⅡA抗体进行阻断试验,测定血清转氨酶水平,HE染色观察肝组织病理学变化。结果ConA诱导的急性肝损伤模型小鼠血清转氨酶水平明显升高,ActivinA及ActRⅡAmRNA转录水平也明显高于对照组;体内应用抗ActivinA和ActRⅡA抗体阻断ActivinA和ActRⅡA的作用,均可不同程度减轻肝损伤。结论ActivinA是介导ConA诱导小鼠急性肝损伤的重要致病因子,阻断ActivinA的表达或其作用途径,可能成为治疗肝损伤疾病的有效靶点。     

激活素A及激活素结合蛋白在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达

目的探讨激活素A(Activin A)及激活素结合蛋白(Follistatin,FS)在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达。方法通过1次/12 h给予小鼠5 g/Kg酒精连续灌胃3次,复制急性酒精性肝损伤小鼠模型,采用实时定量RT-PCR检测小鼠肝组织Activin A及FS mRNA表达水平,免疫组织化学染色观察小鼠肝组织Activin A及FS蛋白的表达水平。结果急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.01);FS mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A-FS表达失衡,以Activin A升高为主,提示Activin A-FS系统失衡可能与酒精性肝损伤有关。     

激活素A对L929细胞活性的调节作用

目的探讨激活素A对小鼠纤维母细胞L929活性的调节作用。方法用不同剂量的激活素A刺激L929细胞,应用还原酶法分析细胞分泌一氧化氮(NO)的水平,RT-PCR法检测细胞诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、纤维连接蛋白(FN)和金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)mRNA的表达,应用中性红检测细胞的吞饮活性,MTT法检测细胞的增殖活性。结果L929细胞经激活素A刺激后,与对照组细胞比较,分泌NO的水平明显升高,iNOS mRNA及FN mRNA的表达水平也升高,而TIMP mRNA的表达水平无明显改变。激活素A可以促进L929细胞的吞饮活性,但对L929细胞的增殖活性无影响。结论激活素A具有促进L929细胞分泌炎性介质和形成细胞外基质的作用,这可能是其促进炎症发展、诱导组织纤维化的原因。     

激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞吞饮活性及TLR4表达的双向调节作用

目的探讨激活素A(ActivinA)对巨噬细胞系RAW264.7细胞活性的调节作用及其可能的机制。方法取对数生长期的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,加入1μg/ml脂多糖(LPS),继续培养8h,采用ELISA法检测细胞分泌ActivinA水平;分别加入ActivinA、LPS和ActivinA+LPS,中性红染料法检测细胞吞饮活性;流式细胞术分析细胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ及Toll样受体4(TLR4)的表达水平。结果LPS呈时间依赖性刺激RAW264.7细胞分泌ActivinA;ActivinA可明显促进静息RAW264.7细胞的吞饮活性,而对MHCⅠ、MHCⅡ及TLR4的表达水平无明显影响;ActivinA和LPS共同作用,ActivinA明显抑制了LPS活化的RAW264.7细胞的吞饮活性,并下调TLR4的表达。结论ActivinA可能以自分泌/旁分泌形式参与巨噬细胞活性调节,其抑制LPS作用与TLR4表达有关。     

糖基化终末产物对大鼠肾小球系膜细胞尾加压素Ⅱ及G蛋白偶联受体mRNA表达的影响

目的观察不同浓度糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)及AGEs作用不同时间对大鼠肾小球系膜细胞尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)及G蛋白偶联受体(G-protein-couple receptor,GPR14)mRNA表达的影响。方法制备AGE-BSA,体外培养大鼠肾小球系膜细胞(Mesangial Cells,MC),加入不同浓度的AGE-BSA(终浓度分别为0、25、50、100和200mg/L),37℃孵育24h;加入100mg/L AGE-BSA,分别培养0、2、8、16和24h,以不含葡萄糖的BSA作为对照。收集细胞,采用RT-PCR检测各组MC UⅡ及GPR14mRNA的表达。结果 AGE-BSA各组MC UⅡ及GPR14mRNA的表达量均随AGEs浓度的增加而增加,50、100和200mg/L与0mg/L组比较,差异有统计学意义(P<0.05);100mg/L AGE-BSA各组MC UⅡ及GPR14mRNA的表达量随着作用时间的延长而增加,作用8、16、24h组与0h组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。BSA组MC UⅡ及GPR14mRNA的表达量无明显增加(P>0.05)。结论 AGEs能上调大鼠MC UⅡ及GPR14mRNA的表达。