破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。     

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。     

破伤风毒素及其片段的纯化

本文报道了破伤风毒素及其片段AB、BC、A和C的纯化方法。应用硫酸铵沉淀和Ultrogel AcA_(34)凝胶过滤制备的纯化毒素,于SDS-PAGE和PAGE中均形成单一的蛋白带,分子量为15万,pI为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg。毒素经DTT还原、尿素处理、再用Ultrogel AcA_(44)凝胶过滤制备A和BC片段。A片段的分子量为54000,pI为4.8。BC片段的分子量为98 000,pI为7.2。木瓜酶处理毒素后用高压液相层析制备AB和C片段。纯化的AB片段分子量为98 000,于等电聚焦中为2条主要区带,pI为5.3和5.5,另有数条小区带;纯化的C片段分子量为51000,于PAGE中形成5条蛋白带,于等电聚焦中主要区带的等电点为7.3,另有几条小区带。     

破伤风毒素及其片段的免疫效果

本文首次报道了破伤风毒素及其片段和片段组合对小鼠的免疫效果。通过凝胶过滤和离子交换等方法提纯了破伤风毒素及其片段。各片段中残余素素的污染率为0～0.8%。将各片段给小鼠免疫均能诱导产生保护性抗体,用破伤风毒素攻击后能使部分小鼠免于死亡。当免疫小鼠的血清抗体滴度>1∶4(0.01HAU/ml)时,小鼠在毒素攻击后一般可免于死亡,当血清抗体滴度>1∶128(0.5HAU/ml)时,则小鼠经攻毒后一般不表现出任何中毒症状,当血清抗体滴度处于二者之间时,小鼠一般表现有破伤风中毒症状,但大部分可以存活。毒素的三个片段均能诱导产生保护性抗体,但存在着明显的差别。     

破伤风毒素及其AB片段对金鱼的毒力

作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果表明,破伤风毒素可作用于金鱼的外周神经系统,而 AB 片段则不能。毒素与其受体结合是毒素对金鱼作用所必需的。     

破伤风毒素全基因片段PCR扩增、克隆和序列分析

目的 对破伤风毒素全基因片段扩增、克隆和测序,以便有效利用。方法 根据A、B、C3个片段的基因序列,分别设计上游和下游引物,采用PCR扩增,并克隆3个片段,进行序列测定。结果 所克隆的基因（AF389424）与GenBank中的基因序列比较变异较小,C片段基因与国内克隆株AF154828相同。结论 为进一步研究、利用奠定基础。     

破伤风毒素重组质粒的构建及应用

目的构建含破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)特异性基因片段的重组质粒,并对其进行应用。方法采用PCR方法,以破伤风灭活菌株基因组DNA为模板,扩增TT的3个特异性基因片段,连接至pMD19-TSimple载体,构建重组质粒pMD19-TTx,以其为阳性参照对模拟破伤风危险品进行PCR检测。结果 PCR及测序证明重组质粒构建正确,以其为阳性参照可快速检出破伤风模拟危险品。结论成功构建了TT重组质粒pMD19-TTx,为破伤风梭菌的检测提供了阳性参照。     

破伤风毒素的提纯及形成离子通道的特性

应用硫酸铵分段沉淀和 Ultrogei AcA_(34)凝胶过滤对破伤风毒进行了提纯,并对形成的离子通道在中毒作用中的功能进行了讨论。提纯的毒素与抗粗制毒素血清形成一条沉淀线,于聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成单一的蛋白带,分子量为15万,等电点为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg 蛋白。给小鼠注射低剂量毒素引起迟发性强直性痉挛;注射高剂量毒素引起快速的类肉毒毒素的松弛性麻痹,直至死亡。应用 Patch clamp 技术,破伤风毒素于人工磷脂膜上形成离子通道。只有当膜两侧存有 pH 梯度时毒素才形成离子通道,因此是 pH 依赖的。通道的电导系数为9 PS。     

破伤风毒素C片段基因克隆及重组表达研究

破伤风毒素片段C分子不具备神经毒毒性，在动物实验中可诱导小鼠产生中和抗体，并能保护小鼠抗破伤风毒素攻击，是理想的亚单位疫苗候选者。我们用基因工程技术在大肠杆菌中重组表达破伤风毒素片段C抗原，为研制新型破伤风疫苗打下基础。从破伤风梭状芽胞杆菌中提取其总DNA，取100ngDNA，利用PCR技术从中扩增出1.4Kb的破伤风毒素片段C基因。扩增产物经限制性内切酶BurnHI、Sail在37C酶切消化后，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化，随后克隆进大肠杆菌谷航甘防流基转移酶融合表达载体PGEX－4T－2相应的限制性内切酶克隆位点，组建成重…     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

18C型肺炎球菌荚膜多糖-TT结合物中多糖片段长度对其免疫原性的影响

目的研究18C型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合物中多糖片段的大小对其免疫原性的影响。方法采取乙酸水解多糖,Sephacryl S-300(XK-50)柱纯化多糖片段,ADH法制备结合物,免疫小鼠,检测血清的ELISA抗体滴度、亲和力以及调理吞噬能力。结果得到重复单位数分别为27、25、19、12、10、9和8的多糖片段。与TT制备的结合物在小鼠体内均能诱导产生IgG型抗体,并存在加强免疫效应,表现出T-细胞依赖型抗体免疫反应。随着链长度的缩短,血清GMT有增加的趋势,但只有8RUPn18C-TT与27RUPn18C-TT组之间差异有显著意义。当吞噬率为50%时,血清的稀释倍数分别为35.10、39.60、45.71、104.71、117.00、145.50和478.60。此趋势与抗体滴度呈正相关,但各组间亲和力差异无显著意义。结论较短多糖片段制备的结合物免疫原性高,血清GMT高,调理吞噬能力也强。     

SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段。方法用PCR方法克隆SARSS2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达。表达产物经SDSPAGE及Westernblot鉴定,阴离子交换层析纯化。结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品。结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品。