检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。     

病毒性肝炎相关职业人群戊型肝炎疫苗认知度及接种意愿调查

<正>戊型病毒性肝炎(简称戊肝)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染引起的急性病毒性肝炎。我国是戊肝高发地区,国家卫生和计划生育委员会传染病报告系统统计显示,我国戊肝发病人数呈明显上升趋势,2012年首次超过甲型肝炎,成为急性肝炎的第一大病因[1]。戊肝平均住院治疗费用在各类病毒性肝炎中最高(约2万元以上)[2],加重了患者的负担。在科技部、卫计委、教育部等各级领导的关心与支持下,2012年10月27日,全球首支戊肝疫苗在     

重组戊型肝炎疫苗抗原P179表征分析

目的对重组戊型肝炎疫苗(recombinant hepatitis E virus,rHEV)抗原P179表征进行分析。方法取3批HPLC及电泳纯度均为100%的rHEV抗原P179原液,采用SDS-PAGE法检测相对分子质量及二聚体含量;OPA-FMOC全自动柱前衍生-Amino Quant氨基酸分析法测定氨基酸组分;电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(electrospray ionizationquadrupole time-of-flight-mass spectrometry,ESI-Q-TOF2-MS)法分析C-末端、Edman降解法测定N-末端氨基酸序列;HPLC法进行肽图分析;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;圆二色光谱仪分析其二级结构;透射电镜负染法观察蛋白颗粒状态;双抗体夹心ELISA法检测抗原活性。结果 3批rHEV抗原P179相对分子质量在17 500~21 300之间;二聚体占总蛋白的85%以上;氨基酸组分、C-末端氨基酸序列、N-末端氨基酸序列、肽图、等电点等均与预期相符;3批rHEV抗原P179二级结构中,α螺旋4.8%~5.6%,β折叠34.8%~36.4%,β转角20.8%~22.2%及无规卷曲37.7%~38.0%;透射电镜观察可见大小均一,粒径约20 nm的蛋白颗粒;抗原活性比值在5.0×105~2.0×10~6CCU/mg范围内。结论 3批r HEV抗原P179结构特征均一,与设计相符,为该疫苗的产业化奠定了基础。     

RT-PCR法检测庚型肝炎病毒C(GBV-C)RNA

应用RT－PCR法在非甲～非戊型肝炎患者血清及单采浆站供血员血浆中检测到GBV－CRNA，扩增产物经序列测定进一步确证，在30例非甲～非戊型肝炎患者中阳性率为6．6％；在600例单采浆供血者血浆中阳性率为0．33％。提示GBV－C可能不是非甲～非戊型肝炎的主要致病因子，可能存在GBV－C健康携带者。     

重组戊型肝炎疫苗原液长期稳定性评价

目的评价重组戊型肝炎疫苗原液的长期稳定性。方法将连续3批重组戊型肝炎疫苗原液置(-20±2)℃保存12个月,分别于第0、3、6、9和12月取样,依据《中国药典》第三部和第四部(2015版)和《重组戊型肝炎疫苗制造及检定规程(暂定)》规定进行无菌检查、蛋白含量、纯度、相对分子质量、等电点和细菌内毒素检测及紫外光谱扫描;第6和12月,分别将3批原液配制成疫苗进行效力测定。结果 3批疫苗原液在各时间点无菌检查均为阴性,细菌内毒素含量均小于5 EU/ml,蛋白含量在3.47~3.81 mg/ml,单体及二聚体总量在96.0%以上,二聚体占总蛋白的85%~100%,单体相对分子质量为19 500~19 700,等电点检查主区带在4.05~5.80之间,紫外光谱扫描最大吸收峰在(278±3)nm,3批原液第6和12月的效力ED_(50)值≤1.0μg,均符合暂定制检规程。结论重组戊型肝炎疫苗原液在(-20±2)℃可稳定存放12个月,本研究为原液的存放效期提供了可靠的数据支持。     

戊型肝炎病毒感染对补体系统表达的影响

目的 探讨补体在戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染孕妇及非孕妇患者中的表达水平.方法 采用免疫比浊法检测HEV感染孕妇及非孕妇患者血清中补体固有成分C3及C4水平;RT-qPCR法检测HEV感染孕妇及非孕妇患者全血中补体C3aR、CD55和CD59的表达水平.结果 HEV感染激活补体C3、C...     

重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性

目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。     

新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一步法RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据NDV F基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立一步法RT-PCR检测方法,并验证其特异性及敏感性;应用建立的方法对23份疑似新城疫(Newcastle disease,ND)病料进行检测,并与血凝及血凝抑制试验检测结果进行比对。结果建立的一步法RT-PCR同时检测NDV、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H9亚型,仅NDV为阳性,IBDV和AIV H9均为阴性;该方法最低可检出约4 pg的NDV RNA;23份疑似ND病料,一步法RT-PCR检出11份阳性,血凝及血凝抑制试验检出13份阳性,两种方法的阳性符合率为85%。结论建立了NDV一步法RT-PCR检测方法,该方法特异性良好,敏感度较高,用时较短,可从分子水平上对NDV进行早期快速诊断和流行病学调查。     

重组戊型肝炎疫苗的无菌生产工艺验证

采用胰酪胨大豆肉汤培养基进行模拟灌装,对灌装后的注射器进行培养,根据注射器内培养基的污染情况,评估现行重组戊型肝炎疫苗无菌生产工艺的有效性。结果表明:灌装后的注射器经培养均未出现培养基污染,现行重组戊型肝炎疫苗的无菌生产工艺可确保产品的无菌性。     

戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品的建立

目的制备戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品。方法从我国多省血液中心、采浆站收集血清、血浆样品300份,应用国内外5家HEV IgG抗体诊断试剂进行筛选,制备HEV IgG国家参考品,并对参考品的稳定性及适用性进行检测。结果制备了HEV IgG国家参考品,其中阴性参考品30份;阳性参考品10份;灵敏度参考品1份,依据HEV IgG国际标准品进行标化,定量为3 U/ml;精密性参考品1份。参考品经4℃及室温放置10 d,37℃放置7 d,以及反复冻融3次后,测定结果与-20℃放置参考品检测结果一致,稳定性良好。5个厂家试剂对参考品的检测结果显示该参考品具有较好的适用性。结论制备了戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品,为提高诊断试剂的质量奠定了基础。     

戊型肝炎病毒感染的恒河猴急性期粪便中病毒的分离与鉴定

目的 研究准确、快捷、敏感的成型肝炎病毒的分离及鉴定方法。方法 采用蔗糖密度梯度离心法从感染成型肝炎病毒的恒河猴急性期粪便中分离病毒，采用免疫电镜吸附法和ELISA相结合方法进行鉴定。结果 检出率高，重复性好。结论 为戊肝病毒组织培养及进一步研究奠定基础。     

戊型肝炎疫苗评价用小鼠品系的比较

目的比较不同品系及相同品系不同来源BALB/c小鼠对戊型肝炎疫苗(HE疫苗)的免疫应答,探讨适用于HE疫苗评价的小鼠品系,规范疫苗效力评价用动物。方法分别用2家企业制备的HE疫苗免疫BALB/c、C57BL/6、KM和NIH 4种品系小鼠及3种不同公司来源的BALB/c小鼠,均免疫1针,28 d后采血,分离血清,检测抗体应答,计算效力ED_(50)。结果 2家疫苗免疫C57BL/6、KM和NIH小鼠时,各剂量组均表现出敏感应答,提示C57BL/6、KM和NIH小鼠对本研究中的2家疫苗不能灵敏地反映出剂量变化趋势,不适用于HE疫苗效力评价;BALB/c小鼠对2家企业各剂量组HE疫苗均呈现良好的免疫应答,且呈明显的剂量效应关系。3种不同来源的BALB/c小鼠免疫HE疫苗后,抗体应答存在差异。结论 BALB/c小鼠可作为评价HE疫苗免疫原性和效力ED_(50)的模型动物;应用BALB/c小鼠进行疫苗评价时需固定小鼠来源。     

我国戊型肝炎病毒流行特征及其疫苗的应用

戊型肝炎(hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染引起的一种人畜共患传染病。近年来,我国戊型肝炎的报告病例数在急性肝病中呈上升趋势,引起人们的重视。接种疫苗是预防HEV感染的重要措施之一。本文对我国HEV的流行特征及我国自主研制的重组HEV疫苗Hecolin誖的保护效果、不同人群的免疫程序、疫苗质控和标准品等方面的问题作一综述。     

重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺,为其规模化生产奠定基础。方法以目的蛋白的表达量及菌体浓度作为综合评价指标,对重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的摇瓶发酵温度、初始pH值、溶解氧、IPTG浓度及诱导时间进行优化;以摇瓶发酵结果为基础,进一步对发酵罐培养工艺中诱导时机、诱导时间及补料培养基配方进行优化;以确定的罐发酵工艺条件连续发酵5批,验证该发酵工艺。结果最适摇瓶发酵工艺条件为:发酵温度为37℃,初始pH值为7.0,高溶氧,IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为4 h;最适罐发酵工艺条件为:菌体A600值约为40时开始诱导,诱导时间为4 h,补料培养基配方为葡萄糖25%,MgSO4.7H2O 0.5%。按照确定的工艺连续发酵5批,最终菌体A600均达50.0以上,目的蛋白的表达量均高于15%。结论优化的重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺稳定性良好,已达到中试生产规模的要求。     

连续3批戊型肝炎疫苗在18岁以上健康人群中应用的安全性及免疫原性一致性评价

目的 评价连续3批重组戊型肝炎疫苗(大肠埃希菌)(商品名：益可宁^?)的安全性及免疫原性一致性。方法本研究为单中心、随机、双盲临床试验。选取2018年江苏省东台市常住居民符合入组标准的360名18～50岁健康志愿者,按照1∶1∶1随机分成3组,分别接种3个批次的益可宁^?,免疫程序均为0、1、6月,每针次接种后采用主动报告与定期随访相结合的方式进行安全性观察;分别于免疫前(0 d)、全程免疫1个月后(7月)采集受试者外周静脉血,检测血清中HEV-IgG抗体水平,评价不同批次疫苗免疫原性的一致性。结果 不同批次组间不良反应和严重不良事件发生率差异均无统计学意义(χ²=0.211～6.802,P> 0.05)。基于免疫原性符合方案集(Protocol Set-Immunogenicity,PPS-I),3组受试者HEV-IgG抗体阳转率均为100%,抗体几何平均浓度(geometric mean concentration,GMC)分别为18.211、21.784和18.558 U/mL,每两组间比较均符合等效性检验标准。...     

戊型肝炎病毒抗体检测试剂的比较

目的比较国内外戊型肝炎病毒(HEV)抗体检测试剂的差异。方法用4种抗-HEVIgM试剂和5种抗-HEVIgG试剂分别检测66份急性肝炎患者血清及77份采自17名急性肝炎患者的系列血清,比较各试剂检测结果之间的差异。结果检测66份急性肝炎患者血清样本时,M1、M2、M3和M4试剂检出的IgM抗体阳性率分别为47.0%、71.2%、42.4%和40.9%;G1、G2、G3、G4和G5试剂检出的IgG抗体阳性率分别为77.3%、87.9%、66.7%、81.8%和66.7%。检测77份系列血清样本时,M1、M2、M3和M4试剂检出的IgM抗体阳性率分别为64.9%、84.4%、31.2%和32.5%;G1、G2、G3、G4和G5试剂检出的IgG抗体阳性率分别为94.8%、98.7%、83.1%、96.1%和88.3%。结论抗-HEV抗体检测试剂,尤其是抗-HEVIgM抗体检测试剂之间存在较明显的差异,临床上应结合检测HEV其他标志物对HEV感染进行综合判断。     

戊型肝炎病毒ORF2抗原的制备及其免疫原性评价

目的制备戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)ORF2抗原,并对其免疫原性进行分析。方法通过基因合成获得HEV ORF2目的基因,构建重组杆状病毒,并在sf9昆虫细胞中优化表达;采用超声、硫酸铵沉淀及层析纯化HEV ORF2蛋白,免疫小鼠分析其免疫原性。结果制备的重组杆状病毒滴度为1×108 PFU/m L;重组蛋白表达条件MOI为1,收获时间为5 d时,表达量最高为20 mg/L;通过纯化获得HEV ORF2蛋白纯度 95%;其疫苗组血清特异性抗体效价与PBS对照组比较差异有统计学意义(P 0. 05)。结论成功表达并纯化了HEV ORF2蛋白,该纯化方法可获得纯度较高的目的蛋白,且制备的HEV ORF2蛋白具有很好的免疫原性,可用于制备和开发预防性疫苗。     

戊型肝炎病毒ORF2N-端和C-端多肽的抗原性分析

目的分析戊型肝炎病毒(HEV)ORF2N-端和C-端多肽的抗原性。方法以纯化的4型HEVORF2N-端1～124aa多肽pS4-1和4型HEVORF2C-端385～674aa多肽pS4-6分别包被微孔板,采用间接酶联免疫法(EIA)检测感染HEV的猴系列血清中的抗HEVIgG抗体,分析两种多肽的抗原性,并与进口试剂的检测结果进行比较。结果在感染HEV的猴系列血清中,针对HEVORF2N-端抗原的抗体产生时间早,持续时间短,其峰值与转氨酶(ALT)的峰值几乎重叠;针对HEVORF2C-端抗原的抗体在HEV感染早期产生的滴度较低,但逐渐升高,在14周的观察期内,抗体滴度几乎无下降趋势。用两种多肽检测HEVIgG抗体的灵敏度均高于进口试剂。结论两种多肽均具有较好的抗原性,但在HEV感染的不同时期,其反应性不同。     

戊型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒制备及功能验证

目的：建立一种快速、简单实用的检测戊型肝炎病毒IgM抗体的胶体金免疫层析法。方法：用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用鼠源人IgM单克隆抗体进行胶体金标记,采用胶体金免疫层析技术及间接法原理检测戊型肝炎病毒IgM抗体,优化抗体最适宜浓度、抗体稀释度及包被抗原浓度,利用市售ELISA免疫吸附试剂对100例临床血清标本进行比较实验。结果：鼠抗人-IgM抗体标记最适合蛋白用量为10 μg/mL、金标鼠抗人-IgM抗体最适合的稀释度为8%、最佳抗原包被浓度为1.0 mg/mL;与酶联分析法对比,阳性符合率98.1%,阴性符合率100%。结论：HEV-IgM胶体金免疫层析试剂,方法简便、快速,适应戊型肝炎早期感染的快速检测及科研工作需要。     

重组戊型肝炎疫苗的生殖毒性试验

目的探讨重组戊型肝炎疫苗对大鼠的生殖毒性。方法将Wistar雌性大鼠分为4组:低剂量组(每只20μg HEV)、高剂量组(每只40μg HEV)、生理盐水对照组及佐剂对照组,每组30只。雌鼠于交配前给药2次,初次给药后2周进行2次给药,2次给药后1周,进行雌雄鼠合笼交配,于妊娠7和14 d进行3、4次给药。每天观察雌鼠一般临床症状;交配前每周称雌鼠体重1次,交配后每周称体重2次,每周定期测定1次摄食量;于妊娠21 d安乐死孕鼠,分离出胎仔,检测疫苗对雌鼠生殖能力、胎仔发育、胎仔骨化程度、胎仔内脏畸形的影响,取孕鼠和胎仔血液,分离血清,ELISA法检测抗HEV Ig G抗体水平。结果各组大鼠精神状态未见异常,皮毛光亮,灵敏,大小便色正成形,注射局部未见充血、肿胀、溃烂、硬结等;疫苗对孕鼠体重、摄食量均无明显影响(P0.05);各剂量组窝平均着床数、窝平均黄体数、窝平均活胎数、受孕率、活胎率、吸收胎率、死胎率、畸胎率与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔身长、尾长、体重、胎盘重和性别比与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔上枕骨的骨化程度均在0级和Ⅰ级正常范围以内,胸骨骨化不全率与生理盐水及佐剂对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);各组胎仔内脏均未见畸形;孕鼠及胎仔血清中均检测到抗HEV Ig G抗体。结论重组戊型肝炎疫苗对孕鼠及胎仔安全、有效。