幽门螺杆菌尿素酶的提取与纯化

采用2种方法分离纯化了幽门螺杆菌尿素酶。第1种方法是以 DEAE-sepharose FF离子交换剂和Superdex 200凝胶为分离介质,用 NaCl盐浓度梯度洗脱法从幽门螺杆菌超声上清液中提取纯化尿素酶抗原,所得到的纯化尿素酶经SDS-PAGE电泳分析,表明它具有很高的纯度,只含有分子质量为64 000 u和31 000 u两种蛋白成分,分别对应于幽门螺杆菌尿素酶的A、B两种亚基。第2种方法是以 DEAE-sepharose FF离子交换剂为分离介质,采用先去掉部分杂蛋白的方法纯化尿素酶,其中的去杂步骤操作简单、快捷且处理样品量大,大大减轻了后面纯化步骤的难度,适合于尿素酶的大量制备。纯化的尿素酶作为抗原采用ELISA间接法检测抗HP蛋黄免疫球蛋白(IgY),实验表明,其仍具有良好的抗原性,是HP主要抗原物质。应用纯化尿素酶抗原或纯化尿素酶抗原与超声粉碎抗原的混合抗原刺激蛋鸡应该能够产生抗HP效价更高的蛋黄免疫球蛋白,可以将其应用于保健或各种与HP相关的胃病的抗菌免疫治疗。     

荧光PCR方法定量检测食品中香菇成分

摘要：【目的】为辨别出口商品和国内市场中谎报香菇成分、以次从好的菌菇产品,准确核定菌菇产品的价格,打击出口骗税等不法行为,特应急研究开发本方法。【方法】选取香菇基因组单拷贝核基因Hydrophobin Protein基因,设计香菇种属特异性引物,扩增107 bp的片段,用于荧光PCR定量检测。分别以3种香菇作为阳性对照和14种非香菇菌种、植物产品作为阴性对照,测试实时荧光PCR引物和探针的特异性。以香菇标准DNA进行8个浓度梯度稀释,测试本定量方法绝对定量限。制备12个梯度含量的香菇DNA样品,测试香菇相对含量的标准曲线。【结果】结果表明本研究建立的香菇荧光PCR定量检测方法对香菇物种的特异性好,与其他食物物种无交叉结果,荧光PCR扩增效率为0.90,绝对定量限LOQ为0.01 ng和含量检测LOQ为0.05％。【结论】本方法重复性和实用性好,可以满足食品和调味料中香菇含量定性定量检测要求。     

应用PCR快速检测食品中沙门氏杆菌方法的研究

本研究利用沙门氏杆菌属特异的inv A基因序列，设计一对特异性的引物，通过PCR反应来检测多种样品中的沙门氏杆菌；反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果显示：此PCR方法检测沙门氏菌属的特异性为100％：样品中活菌的检测限为1．43CFU／10g：反应的最佳退火温度是65℃；最适模板浓度范围在10^4～10^8copies／ml。本方法与传统的沙门氏杆菌检测方法以及最近报道的相关方法比较，具有简单、快速、特异性好和敏感性高、经济等特点，并可满足大批样品沙门氏杆菌筛选检测的要求。     

牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌污染及检测技术研究进展

近年来大量研究已经表明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）可能是种食源性致病菌,而牛、羊乳是其最可能的感染源。食物中较难分离培养出Hp,而聚合酶链式反应相关技术灵敏度高,能检出样品中微量的Hp,可用于检测牛、羊乳中幽门螺杆菌的污染情况,但是与人类临床方面检测Hp技术的多样性、特异性与成熟性相比,食品中Hp快速而有效的检测方法及相关标准还相对缺乏。本文主要就近年来牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌污染及检测技术的研究进展进行综述,为进一步完善Hp传播途径与致病机制等研究提供一些参考。     

食品中沙门氏菌恒温隔绝式PCR检测方法的建立

为弥补传统培养方法耗时长和现场检测步骤繁琐等缺陷,该研究建立了一种针对食品中沙门氏菌的恒温隔绝式PCR快速检测方法.根据沙门氏菌的invA基因设计特异性引物和探针,通过水浴法快速提取细菌DNA,优化引物、探针以及模板用量,建立了一种基于恒温隔绝式PCR快速检测沙门氏菌的方法,并对方法的特异性和灵敏度及稳定性进行评价,最...     

PCR检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱携带情况,探讨与食物中毒发病相关的金黄色葡萄球菌基因类型。方法:取食品中检出的金黄色葡萄球菌进行分离培养鉴定,通过PCR技术检测样本18种不同型的肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果:食品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素基因有较高的阳性检出率,主要检出sea、seb、sei、seg、sel、sem、sen等基因,其中sea基因检出率最高,达到77.27%;sei、seg、sem、sen基因具有相关性,检出率为9.09%;seb、sel基因的检出率为4.55%。结论:在食品中主要检出金黄色葡萄球菌肠毒素sea、sei、seg、sem、sen、seb、sel等基因,其中,sei、seg、sem、sen基因的相关性还有待进一步深入研究。     

转基因食品的定量PCR检测方法

近年来转基因食品定性检测方法发展迅速,然而目前转基因成分(GMO)的准确定量检测在国际贸易中日趋重要.我们这里介绍三种定量检测方法半定量PCR法,定量竞争PCR(QC-PCR)法和实时定量PCR法.半定量PCR法比较简单,但结果不是很精确.定量竞争PCR的特点是含有内部标准子.近来开展的实验室合作研究表明,与定性PCR法相比,定量竞争PCR降低了实验室之间的误差.而实时定量PCR法可在提取DNA后3h内,测出每克起始样品的总DNA量及2pg转基因成分的量,但这套PCR系统目前价格昂贵.     

食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR的快速检测

本文运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中常见的乳酸杆菌进行检测的快速方法.针对乳酸杆菌16S rDNA序列,设计了通用引物和特异性探针,进行TaqManTM实时PCR检测,以非同源性参考菌株做特异性检测;把乳酸杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.实验结果表明用实时荧光PCR法检测乳酸杆菌,快速、敏感、特异性高.     

转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究

为了建立以标记基因为检测靶标的高效定性检测方法,本研究系统地分析了日前申请商业化的转基因植物中标记基因的应用频率,选取了应用频率高或在末来应用潜力大的标记基因neomycin phosphotrarsferaseII （NPTll） ,phosphinothricin acetyltransferase （ PAT）, 5 - enolpyrul - shikimate - 3 - phosphate synthase （ CP4 - EPSPS ） ,phosphlnothricin acetyltransferase （bar） ,hygromycin phosphotransferase H（HPTI1） ,β - glucuronidase （GUS） 和 phospho-mannose isomerase （PMI）作为检测靶标,建立了这七个基因的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。该研究建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高、重现性好,适用于农产品中转基因成分的大规模筛查检测,而且应用实时荧光PCR方法可大大提高检测效率,降低检测过程中样品交叉污染和环境污染的几率。     

沙棘提取物对幽门螺杆菌脲酶活性的抑制

探讨沙棘提取物对幽门螺杆菌脲酶(Helicobacter pylori urease, HPU)活性的抑制及相关基因的表达影响。培养幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)提取HPU,通过设置沙棘提取物系列浓度梯度及孵育时间梯度,采用Berthelot法检测HPU活性并评价沙棘提取物对HPU的抑制作用;进行酶活性动力学研究及对抑制位点进行分析;将菌液与不同浓度的沙棘提取物混合后孵育6 h,用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测菌体中脲酶蛋白α亚基(urease subunitα,Ure-α),脲酶蛋白β亚基(urease subunitβ,Ure-β),脲酶辅助蛋白E(urease accessory protein E,Ure-E)和脲酶辅助蛋白H(urease accessory protein H,Ure-H)脲酶基因的表达。结果表明,沙棘提取物对HPU的抑制作用呈时间、剂量依赖性,IC₅₀值为(2.73±0.10)mg/mL。沙棘提取...     

酱香型白酒醇类活性成分抗幽门螺杆菌损伤胃黏膜上皮细胞活性的研究

为研究酱香型白酒醇类活性成分(active alcohols,AAs)抑制幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)损伤胃黏膜上皮(GES-1)细胞活性及潜在的机制,检测了AAs抑制H.pylori的最小半数抑菌浓度(50％minimun inhibitory concentration,MIC50)及苯乙醇...     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测

通过扩增hly基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR方法.该方法具有较强的特异性,35株经传统方法鉴定的菌株PCR结果均为阳性,而其他三种同属异种菌,包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段.PCR方法对上Lm纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl,对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g,牛奶为4CFU/ml.应用该方法对285份食品样品检测,17份样品Lm呈阳性,结果与常规的分离培养方法完全一致.该种方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中Lm的快速检测.     

应用PCR技术快速测定食品中单核细胞增生李斯特菌毒力

目的：采用PCR 技术准确、快速测定单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特氏菌)分离株的毒力基因,鉴别强毒株和弱毒株或无毒株,以有效地限制李斯特氏菌病的传播。方法：以单增李斯特氏菌相关毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)设计引物,检测重庆市2007 - 2009 年分离的40 株单增李斯特氏菌分离株中的毒力基因携带率,并进行小鼠毒力实验。结果：40 株分离株中有15 株7 种毒力基因检测结果均为阳性,6 株hly 基因阴性,4 株plcB 基因阴性,4 株prfA 基因性,5 株inlA、inlB 基因阴性,11 株inlC 基因阴性,9 株inlJ基因阴性,1 株inlA、inlB、inlC、inlJ 基因均为阴性。4 株分离株的毒力与标准菌株ATCC191161E 相当,小鼠LD50 在1.2 × 108～6.0 × 108CFU/mL 之间,为强毒株。筛选出弱毒株09-132,LD50 为1.7 × 1011CFU/mL。结论：重庆市存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险,内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因,而prfA 和plcB 基因与菌株毒力的相关性较小。     

姜黄素对幽门螺杆菌及其诱导人胃GES-1细胞损伤的影响

对姜黄素抑制幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）及其诱导人胃GES-1细胞损伤的影响进行研究。抑菌实验结果显示,姜黄素可明显抑制Hp生长,其最低抑制浓度为200 μmol/L。采用Berthelot显色法检测Hp脲酶活力的变化情况,发现姜黄素对其也有明显的抑制作用,半数抑制浓度为1.735 mmol/L。通过噻唑蓝实验分析姜黄素对人胃GES-1细胞和Hp感染人胃GES-1细胞的影响。结果显示,短时间内（12 h）较低浓度（68 μmol/L）姜黄素对人胃GES-1细胞增殖无明显影响,但姜黄素浓度的增加和作用时间的延长可使细胞存活率明显下降。经68 μmol/L姜黄素作用12 h后,损伤模型组细胞形态有一定程度的复原,细胞存活率略有升高,但不显著（P＞0.05）;高浓度（136、680 μmol/L）姜黄素会导致细胞存活率明显下降。因此,姜黄素对Hp生长和脲酶活力有明显的抑制作用,但不足以缓解Hp对人胃GES-1细胞的损伤作用。     

用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

建立了食品中单核细胞增生性李斯特菌快速、敏感、特异的聚合酶链反应PCR检测方法.选择的引物具有良好的单增李氏菌种的特异性.对人工污染在冷冻食品中单增李氏菌的检测低限是4-8CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7.2-11×103/ml,每PCR反应体系的检测低限为86-132CFU.对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符.     

吡嗪类化合物抗幽门螺杆菌活性及机制研究

该实验研究了吡嗪类化合物（PYRs）对幽门螺杆菌（Hp）的抗菌活性及作用机制。采用PYRs处理Hp菌液,观察Hp的活性及形态变化;利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分析PYRs对Hp基因及相关毒力蛋白表达的影响;检测PYRs预处理Hp对胃黏膜上皮细胞（GES-1）活性、细胞凋亡的影响。结果表明,PYR-19（2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪）可抑制Hp增殖,Hp外膜蛋白基因（BabA）和毒力基因（CagA和VacA）的转录及毒力蛋白（CagA和VacA）的表达,Hp诱导的GES-1细胞炎性细胞因子分泌及对GES-1细胞的损伤,减轻Hp对胃黏膜上皮细胞的损伤能力。